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常规共聚焦显微镜的样品制备有哪些要求

发布日期: 2020-07-15
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     共聚焦显微镜样品制备是检测前的关键步骤。样品需经荧光探剂标记(单标、双标、三标)。
  标本可以是固定的或活的组织,也可以是固定的或活的贴壁培养,细胞应培养在Confocal专用小培养皿或盖玻片上,悬浮细胞,甩片或滴片后,用盖玻片封片。样品的Zda厚度约1~2mm,使用的盖玻片厚度应小于0.17mm,载玻片厚度应在0.8~1.2mm之间,而且表面光洁,厚度均匀,没有明显的干扰荧光。固定样品常用封片剂进行封片,常用PH8.5-9的PBS配制的甘油封片。
  常规样品制备要求:
  1、染料的选择
  由于共聚焦显微镜是以单一波长的激光作为光源,因此在选择荧光染料时要根据共聚焦显微镜配备的激光器波长选择,如果在同一样品中有多种荧光染料标记,还要考虑它们的发射波长尽量不要重叠,避免串色问题。
  2、样品承载物的选择
  一般的共聚焦显微镜高倍物镜均为油镜,它的数值孔径较小,要求镜头与样品之间的工作距离不大于0.17mm,因此如果观察样品为贴壁细胞或组织切片,可以用普通的载玻片和盖玻片即可。如果是悬浮细胞或悬浮粒子,可以用共聚焦显微镜专用的培养皿承载样品进行观察。
  3、封片剂的选择
  如果样品只需要观测一次并且不是极易淬灭的荧光,可以选用一定浓度的甘油混合液封片即可。如果样品需要放置一段时间并多次拍摄,应选用抗荧光淬灭的封片剂,以减少荧光信号丢失。
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