共聚焦显微镜常规样品的制备要求

　　共聚焦显微镜是20世纪80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品，是当今分子生物学和生命科学重要的分析仪器之一。共聚焦显微镜是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察诸多生理信号机细胞形态的变化，成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等科学领域中强有力的研究工具。

　　共聚焦显微镜样品制备是检测前的关键步骤。样品需经荧光探剂标记(单标、双标、三标)。

　　标本可以是固定的或活的组织，也可以是固定的或活的贴壁培养，细胞应培养在Confocal专用小培养皿或盖玻片上，悬浮细胞，甩片或滴片后，用盖玻片封片。样品的Zda厚度约1~2mm，使用的盖玻片厚度应小于0.17mm，载玻片厚度应在0.8~1.2mm之间，而且表面光洁，厚度均匀，没有明显的干扰荧光。固定样品常用封片剂进行封片，常用PH8.5-9的PBS配制的甘油封片。

　　常规样品制备要求：

　　1、染料的选择

　　由于共聚焦显微镜是以单一波长的激光作为光源，因此在选择荧光染料时要根据共聚焦显微镜配备的激光器波长选择，如果在同一样品中有多种荧光染料标记，还要考虑它们的发射波长尽量不要重叠，避免串色问题。

　　2、样品承载物的选择

　　一般的共聚焦显微镜高倍物镜均为油镜，它的数值孔径较小，要求镜头与样品之间的工作距离不大于0.17mm，因此如果观察样品为贴壁细胞或组织切片，可以用普通的载玻片和盖玻片即可。如果是悬浮细胞或悬浮粒子，可以用共聚焦显微镜专用的培养皿承载样品进行观察。

　　3、封片剂的选择

　　如果样品只需要观测一次并且不是极易淬灭的荧光，可以选用一定浓度的甘油混合液封片即可。如果样品需要放置一段时间并多次拍摄，应选用抗荧光淬灭的封片剂，以减少荧光信号丢失。