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徕卡超薄切片技术介绍

发布时间:2021-03-26      点击次数:314

对样本开展研究时,为了以纳米级分辨率显示其精细结构,通常会使用到电子显微镜。

电子显微镜有两种类型:扫描电子显微镜(SEM)用于对样本表面成像,以及需要使用极薄电子透明样本的透射电子显微镜(TEM)。因此,使用电子显微镜对样本内部的精细结构进行成像时,此类技术解决方案需要制作出非常薄的样本切片。被称为超薄切片技术的样本制备方法可以产生具有最小假象的超薄切片(厚度20-150nm)。

在切片过程中,样本的块面(切割切片处)始终保持在一个平直的表面上,可供SEM进行研究。当截面在阵列中成像时,就可以重建样本的三维图像。这种方法称为阵列断层扫描(AT)。超薄切片技术及其在AT中的应用概述如下。

 

超薄切片技术

 

超薄切片技术主要用作透射电子显微镜(TEM)的样本制备方法。它允许样本的内部结构以纳米级分辨率进行可视化和分析。它以快速、干净的方式制作超薄的样本切片。超薄切片技术的一个主要优点是切片内电子透明区域的大小和均匀性以及切片产生的速度。

超薄切片技术可用于多种类型的样本,包括生物学试样和工业材料如聚合物(橡胶和塑料)以及韧性、硬质或脆性材料(金属或陶瓷)等。制备这些样本薄片还有其他技术,如聚焦离子束(FIB)铣削、离子刻蚀、三脚架抛光和电化学处理,但超薄切片技术在速度和清洁度方面具有优势。

阵列断层扫描 (AT) 是一种用于细胞和蛋白质结构分析的高分辨率三维图像重建方法。该技术利用扫描电子显微镜(SEM)或光学显微镜(LM)中超薄、树脂包埋连续切片的有序阵列成像。AT技术能够对细胞及蛋白质结构开展定量立体结构分析和可视化观察。其横向和空间分辨率比传统的共焦显微镜更理想。此外,通过生物试样的部分自动化检测来实现更高的处理量。

 

超薄切片原理


利用阵列断层扫描进行TEM观察以及实现优化3D重建时,超薄有序的切片是一大前提。超薄切片机(如徕卡显微系统的EM UC7)则可以制作出此类超薄的样本切片(厚度20 ~ 150 nm)。

要在透射电子显微镜中形成样本的图像,电子必须在不出现任何重大速度损失的情况下穿透样本。样本对电子辐射的渗透率部分取决于其质量和厚度(厚度×密度),部分取决于电子显微镜的加速电压。被试样吸收的电子会导致热量积聚,从而在物体中形成假象。

 

图1:显示超薄切片机样品臂、刀座和水槽式玻璃刀的侧视图。

 

使用超薄切片机进行切片时,需将样本插入安装在特殊轴承上的样品臂当中,由该轴承执行垂直切割运动。切割截面并缩回试样支臂后,极其准确的机电进给将试样稍微向前移动,移动距离与所需截面厚度相对应。通过将试样垂直移动到固定玻璃刀或金刚石刀的锋利刀片上进行切片。由于切片过薄,直接从刀片上取下切片很困难。

因此,它们是在切片程序后从水槽中水面上收集的(或在冷冻切片的情况下借助显微操作器)。在用电子显微镜(EM)检查之前,可能需要做任何进一步的准备。

 

阵列断层扫描的试样制备

 

为AT制备生物学软试样时需要完成若干步骤的操作。这些步骤包括:

  • 组织固定
  • 试样提取和树脂包埋
  • 连续切片和切片带收集,形成切片阵列
  • 视需要对切片进行染色以供成像。

然后通过SEM或LM(通常为荧光)对切片阵列成像。后续将阵列中的切片图像合并在一起进行3D图像重建和分析。

很多超薄切片机的AT样本制备涉及多个耗时繁琐的手动操作步骤。高级超薄切片机(如徕卡显微系统ARTOS 3D)则可通过试样切片的自动化处理来加速整个制备过程,最大限度缩短SEM或LM成像中的切片处理时间。

 

应用图像

 

图2:阵列断层扫描(ARTOS 3D)高级超薄切片解决方案的金刚石刀头图片,可用于执行自动连续切片。可见厚度均匀的无褶皱条带漂浮在水槽内的水面上。

 

 图3:黄金的切片表面– AFM图像

 

图4:铜与黄金层的横截面 – TEM图像。感谢德国WWU Münster提供的图片

 

图5:通过阵列断层扫描采集到的小鼠淋巴细胞的3D图像重建。感谢奥地利克洛斯特新堡科技研究院(IST)提供的图片。

 

图6:酸硫杆状菌 HV2/2。感谢马堡大学Dr. Andreas Klingl提供的图片。

 

图7:大鼠肾脏。感谢德国汉堡大学L. Edelmann提供的图片。

 

图8:拟南芥。感谢根特大学Riet De Rycke提供的图片。

 

图9:拟南芥。感谢根特大学Riet De Rycke提供的图片。

 

图10:小鼠心脏。感谢根特大学Riet De Rycke提供的图片。

 

图11:小鼠心脏。感谢根特大学Riet De Rycke提供的图片。

 

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