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荧光寿命成像助力攻克癌症热点靶标——四链DNA结构

发布时间:2021-07-06      点击次数:67

1953年,科学家詹姆斯-沃森和弗朗西斯-克里克发现了DNA分子的双螺旋结构,遗传学的研究进入到分子层次,人们可以更深层的了解遗传信息的构成和传递途径(图1A)。近年,科学家在人类癌症细胞中发现一种四重螺旋体DNA分子——G-四链体(G-quadruplex)。它是由富含串联重复鸟嘌呤(G)的DNA或RNA折叠形成的高级结构。G-四分体(G-quartet)是四链体的结构单元,由Hoogsteen氢键连接4个G形成环状平面,两层或以上的四分体通过π-π堆积形成四链体(图1B)。
 
有研究表明,G-四链体更多的出现在癌细胞等快速分裂的细胞中,与癌基因的启动子区域和DNA链的端粒区域相互作用。因此,G-四链体结构与DNA复制过程有着紧密联系,对于细胞分裂和增殖非常关键[1]。那么,通过靶向调控G-四链体结构将有望成为选择性抑制癌细胞增殖的新途径,G-四链体也成为了癌症治疗药物的重要靶标。

图1.A:James Dewey Waston(左)& Francis Harry Compton Crick(右)

B:G4-DNA的3D结构
鉴于G4-DNA参与到很多生物过程当中,开发用于检测和可视化细胞中 G4-DNA 结构的工具也尤为重要。伦敦帝国理工学院的研究人员开发了一种能够在活细胞中检测G4-DNA的荧光探针——DAOTA-M2,为人们揭开了这种结构的神秘面纱 [2]
 
这种探针具备良好的活细胞渗透性和低细胞毒性,在与G4-DNA结合时会发出荧光,可以用来观察G4-DNA是如何与活细胞内的其他分子相互作用的。并且当DAOTA-M2与不同的核酸拓扑结构结合时,将显示出不同的荧光寿命信息,进而可以非常精准的区别双螺旋DNA和G4 DNA(图2),因为与四链体结合时荧光寿命更长(图3)。

图2. 荧光寿命置换测定的示意图:竞争对手结合后,DAOTA-M2 从 G4-DNA 转移到 dsDNA环境,导致其荧光寿命缩短


图3 DAOTA-M2染色的活细胞U2OS细胞核DNA的FLIM分析(a)以 512 × 512 分辨率(λex=477 nm,λem=550–700 nm)记录的荧光强度图像,红线表示用于 FLIM 分析的核分割(b) 来自 a 的 FLIM 图,显示在平均寿命 (τw) 9ns(红色)和 13ns(蓝色)之间(c) 平均核强度与平均核寿命(蓝点)的二维相关性(d)单个原子核的放大 FLIM 图 - 颜色代表寿命,由 9ns(红色)和 13ns(蓝色)之间的颜色梯度条定义

G4-DNA的生物功能是通过动态的折叠和打开实现。在细胞内,G4-DNA可以自发折叠,但其打开是由专门的解旋酶来完成。并且在接下来的研究中,科学家发现哺乳类动物中的DNA 解旋酶 FancJ 和 RTEL1的表达量减少将会导致DAOTA-M2荧光寿命变长(图4)[3]。因此可以直接利用DAOTA-M2荧光寿命的变化监测G4-DNA在活细胞中的动态变化

图4,减少 FancJ或RTEL1 解旋酶表达如何导致更长的 DAOTA-M2 寿命 (τw)的示意图
G4-DNA被认为是潜在癌症治疗药物靶点,因此评估给定的 G4-DNA靶向药物与该结构结合的能力将非常有用。通过不同处理后DAOTA-M2的荧光寿命变化,结果显示双羧酸功能化的Ni(Ni-salphen)与G4-DNA有很强的靶向结合能力,会在短时间内导致DAOTA-M2荧光寿命迅速下降。(图5)

图5. 加入结合剂1-7hr的DAOTA-M2 的代表性 FLIM 成像结果(显示在 6ns(红色)和 14ns(蓝色)之间)共孵育后 使用 DMSO(对照)、Zn-salphen、Nisalphen 。比例尺:20 μm

在以上的科研工作中,不难发现,精准的检测方法是必须的,比如贯穿于整篇文献中的FLIM技术。FLIM(Fluorescence Lifetime Imaging,荧光寿命成像):是一种基于荧光寿命的显微成像技术,其成像结果提供像素位点的寿命信息,使得我们在荧光强度成像之外,能更加深入地对样品进行功能性测量。荧光寿命成像具有不同于荧光强度成像的众多优点,如不受荧光物质浓度、光漂白、激发光强度等因素的影响。会因为分子构象、分子间相互作用、分子微环境、生理状态等条件改变而发生变化。Leica全新STELLARIS 8 FALCON荧光寿命成像系统,搭载新一代白激光(440-790nm)以及HyD X高灵敏度专用检测器,提供超快速、多维度荧光寿命成像解决方案。
 
特异性探针与FLIM相结合使用,不仅可以用来监测活细胞细胞核中G4-DNA的形成,以及判定小分子药物与G4-DNA的相互作用,还可以应用于G4-DNA靶向药物的筛选。这些信息将为癌症的诊断和治疗带来了新启示,更有助于靶向性新疗法新药物的开发。

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