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我和白激光不得不说的故事

发布时间:2021-07-28      点击次数:92
最近公司的公众号推出了“2021年徕卡显微镜用户故事有奖征集大赛",小编看见大奖里竟然有iPad,想想家里那台老古董的iPad Air到现在只能长期插着电源工作,新款的iPad已经躺在我的购物车里半年之久了,迟迟舍不得剁手,这会儿有此等好事,瞬间两眼放光,动手写篇文章,既完成了KPI,顺便还能拿个大奖,岂不两全其美。然而,打脸来得就是这么快,不仅评奖过程需要经过内部评审和外部投票综合选出,而且明晃晃的标注了“徕卡员工不得参加",哎,还是努力搬砖,等双十一自己买吧。不过遵循惯例,既然“写都写了",就拿出来献个丑,权当是抛砖引玉吧。

小编当年第一次接触激光共聚焦显微镜是在学校的公共平台,当时觉得共聚焦果然不愧为成像神器,拍出的图片好清楚啊。在第一次独立预约使用之前,平台的老师再三叮嘱我,现有的设备配备了405、488、543、633四根激光器,在选择荧光标记的时候,切记选择合适的激发波长,才能够获得理想的结果。作为小白的我,自然谨遵教导,在师兄的指引下,用着实验室常用的DAPI、FITC和TRITC标记细胞,成像效果还真不错,除了拍久了荧光会慢慢淬灭。不过随着仪器操作越来越熟练,动作越来越快,在样品淬灭之前,完成拍图还是不成问题的。

后来听说共聚焦还能做分子间相互作用,用一个叫FRET的模块就能够实现,咨询了平台老师和阅读了相关文献之后,先是了解目前设备现有的FRET功能有FRET AB(受体漂白)和FRET SE(受激发射)两种方法,而因为FRET SE法由于需要准备多种对照样品,后期的计算也极为复杂,“聪明"的我自然选择了相对容易的FRET AB方法,在选择荧光标记的时候发现最常见的CFP和YFP作为供体-受体在我们这因为没有合适的激光器没法做,而我们常用的FITC和TRITC又由于太容易被漂白不适合来做FRET AB实验,最终在文献中看到有Alexa 488和Alexa 568这样一对供体-受体组合,Alexa系列染料向来以稳定性高、不容易淬灭著称,看来是适合FRET AB实验了,和老板软磨硬泡了好几次之后,终于同意下血本买了这两个二抗。

买回来之后,发现这两个荧光标记信号果然很强,稳定性也比之前的FITC、TRITC好多了,543nm的激光器激发Alexa 568虽然效率不是很高,但是把激光器能量打满,检测器的增益调高一点,信号还是很OK的。可做FRET AB的时候,却发现本应发生FRET效应的两个标记在漂白了Alexa 568之后,Alexa 488的信号并没有增强,当时也是百思不得其解,再咨询了其他有FRET经验的老师,他们说,有时候二抗的空间构象也会影响FRET的效果,而且FRET AB的实验结果确实也不太稳定,重复性也不高,好在当时通过其他的实验方法验证了我们研究的两个蛋白确实有相互作用,这个数据不放进去也能够说明问题,也就没有过多的深究了。

毕业之后,进入了徕卡当了一名技术支持,接触的东西多了,才发现随着荧光蛋白的发现和不同荧光染料的开发,在做荧光成像的时候,有太多荧光标记可以选择了,但很多客户受限于购买共聚焦显微镜时选择的有限的几根激光谱线,导致有很多荧光标记无法使用,使得有时候在宽场荧光显微镜上能够使用的染料在共聚焦上反倒效果不好了。

当时经典的激光光源通常仅提供单一的窄带发射。有些气体激光器可以同时发射几种光线,最常见的例子就是氩离子激光器,在蓝绿范围内可以提供5条谱线(458、476、488、496、514 nm)。有些固体激光器虽然可以调节波长,但仅适用红外波段(例如用于双光子成像的Ti:Sa激光器),除了高度精密和极其昂贵之外,它们同一时间仅能发射单一波长的光线,而且调节波长的过程非常缓慢(需要好几秒)。

到了2008年,徕卡基于其强大的研发能力和厚实的专有技术基础,推出了第一款配备超连续光谱激光器的共聚焦显微镜TCS SP5X,可以选择470-670nm范围内任意波长作为激发谱线,好家伙,相当于一次性提供了足足201根激光器。借助200纳米的自由调节激发线,可以让当时绝大多数的染料发挥出最佳激发性能。这种灵活性对于需要为各种应用方向的用户提供各种样品和染料的成像平台来说至关重要。不仅如此,借助专有技术的AOBS声光分光器,能够最多提供8条谱线同时激发。

在学习新产品的过程中,有一个案例让我眼前一亮,这不就是我的例子么,要是当时遇见白激光这样的神器,我也能成为案例里的“张三"了。来自于Genoa的Caorsi V和Diaspro A当时也是拿Alexa 488和Alexa 568这样一对供体-受体组合做FRET AB,他们一开始也采用543nm的氦氖(HeNe)激光来漂白受体Alexa 488。根据公开的激发光谱数据显示,供体Alexa 488对于543nm激光的吸收率足够低(不到2%),因此不会干扰受体漂白。这二位和我一样,实验按照上述方法进行,结果没有检测到供体信号增加,因此可以得出结论,蛋白质并非“共定位"且至少相隔10纳米

然而不一样的结局是,他们经过测试,发现在活体细胞中,供体Alexa 488对543nm的吸收率大约为11%,也就是说,用543nm漂白受体的时候,供体也会被漂白。而使用580nm激光对该受体进行相同实验,供体发射增加了约三分之一,FRET效率达到了32%。580nm距离供体激发足够远,因此供体在受体漂白期间不会受到漂白,并可在FRET受体漂白后发出更多荧光(图一)。可见使用白激光灵活调节激发波长的特性,能够有效避开串色,从而获得更精准的FRET结果


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图一 FRET AB测量。FRET效率可以通过测量受体光漂白之后的供体发射增加获得。上图:在使用传统激光器时,供体发射没有增加(左侧的绿色图片);下图:受体采用白激光将波长调节到580nm漂白受体后,供体荧光明显增强(图片来自:Caorsi V, Diaspro A, Genoa)

看到自家的产品解决了当年困扰自己的难题,既遗憾当初我怎么没碰到这么好的机遇,又庆幸技术的突破给众多科学工作者带来了解决问题的曙光。

白激光除了精准激发、有效避免串色之外,还有很多特性和应用。敬请期待我们后续的推送吧。


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