DMi8与转化医学研究

DMi8与转化医学研究
——如何为您的研究选择和配置显微镜
 
新冠也许是人类已知的作为危险的病毒之一，其传播力强、途径隐秘危害性大，而面临如此大敌，多亏了核酸检测技术发展才可以使其无所遁形。但是核酸检测技术首先都需要对核酸中的信号进行放大，以新版的国家新冠指南中所描述，需要将收集到的DNA进行35个循环的扩展后才可以用于检测，这个参数虽然较之之前的40个循环有所减少，但是放大倍数也有2³⁵之多，可以想象如果中间有任何错误都会被放大如此高的倍数。怎么样才能测得准确呢？标准品是关键的保证之一。
面对新冠的核酸检测方案中的标准品，上海交通大学的樊春海院士在此方面做出了最关键的贡献。2020年初在他主持下的国家转化医学科学中心积极支持下，上海市计量院与交大的联合团队夜以继日攻关，仅用42天及时研发出新冠核酸标准物质——GBW（E）091111和GBW（E）091112，并经国家紧急授权于2020年3月19日获批，为核酸试剂盒提供计量溯源和质量控制依据，供百余家研制单位使用，为疫情防控做出重要贡献和基础保障。拥有170年光学技术沉淀的徕卡显微系统也非常有幸能为樊院士的研究提供力所能及的支持。
 
图片转载自“上海科技”公众号，作者：一诺
工欲善其事必先利其器，在成就伟大的科研成果之前，对设备的配置选择是首要因素之一。光学显微镜通常是生命科学研究实验室的主要设备之一。它可在多种应用中帮助解开科学谜团。因此，从明场显微镜到荧光显微镜和活细胞成像，显微镜的配置和功能对于其应用范围至关重要。
 
 
 
您研究什么样本？
选择研究显微镜时，首要的考虑因素是研究的样本类型。如果是放置在薄载玻片上的固定样本，您可以选用正置显微镜。活细胞检测则需要使用显微镜的特殊功能，因为它们是放在充满细胞培养液的大细胞培养容器中。
 
 
图1：左：放置固定样本的载玻片，例如组织切片。右图：用于细胞培养的有盖培养皿。
只有物镜在样本下方而聚光镜在样本上方的倒置配置，才能提供基本的自由空间和物镜与样本之间的接近度。与此同时，倒置显微镜还可以很好地接近细胞，例如添加显微操纵器。
此外，活细胞需要适当的环境才能生存。温度和二氧化碳浓度必须保持在一定水平。完成这项任务需要一个带有相应控制器的气候室。
 

 
图2：左：正置显微镜的特点是物镜在样本上方，聚光镜在样本下方。右：倒置显微镜的设置恰好相反，主要是为了向用户提供更多空间以及物镜与样本之间所需的接近度。
 
您认为是在哪些维度？
显微样本展开成三个维度：长度、宽度和高度。一些样本，例如组织切片，仅在xy方向上成像，而其他应用可能也需要在z方向上进行采集。成像3D体积，例如，对于活细胞，建议使用电动物镜转盘，它能够逐步引导您的样本通过焦点。成像软件应该能够重建单个图像以进行3D可视化。
对于活细胞，您必须添加时间维度。在这种情况下，系统稳定性便是另一个关键特性。由于在采集过程中温度变化会影响成像系统，因此必须采取有效的应对措施。自适应对焦控制（AFC）等自动对焦调整可消除这些热影响，并始终找到预定义的焦点。
 

图3：自适应对焦控制（AFC）也可以在长时间延时采集期间自动稳定显微镜焦点。传感器检测到LED光束（850 nm）的运动，如果载有样本的盖玻片改变其位置，例如由于热活动，就会发生这种运动。
 
哪种对比方法适合您的样本？
用显微镜研究的大多数细胞——尤其是动物细胞——没有足够的内在对比度来让研究人员观察细节。研究人员使用对比方法来解决这个问题。相衬（PH）和微分干涉对比（DIC）可操纵穿过样本的光以增加对比度，您也可以分别使用荧光蛋白通过荧光染料（免疫荧光）对其进行染色。
根据对比方法，显微镜需要特定的设备；例如相衬需要特殊的物镜，而DIC使用某些必须切换到光路中的棱镜。对于荧光显微镜，您需要特殊的荧光滤色块，以促使正确的光波长进入和退出样本。
 
 
图4：用不同对比方法获得的一系列神经元细胞。从左到右：明场、DIC、相衬、荧光
 
光源呢？
对比方法的选择也决定了光源。用于传统明场显微镜、相衬和DIC的透射光照明可以使用卤素或LED照明进行。荧光显微镜可以通过LED照明或在汞灯、氙灯或汞金属卤化物灯的帮助下进行。
 
您想记录或发布您的结果吗？
如果您想拍摄样本图像或进行活细胞成像，则需要一个数码显微镜摄像头。特别是在荧光活细胞成像的情况下，建议使用灵敏的摄像头，以尽量减少可能伤害细胞的激发光量。除了成熟的CCD和EMDDC摄像头外，如今的sCMOS摄像头也因其高量子效率和采集速度而得到应用。有关数码显微镜摄像头的更多信息，请阅读文章“数码摄像头技术简介”。
此外，大视野（FOV）有助于更快地找到感兴趣的区域并同时成像更多细胞。现代研究显微镜的摄像头端口具有19毫米FOV，与19毫米sCMOS摄像头芯片匹配。
通常，仅拍摄样本图像是不够的，还需要分析您获得的数据。为此，易于使用的成像和分析软件有助于获取定量数据并进行可靠的数据分析。
 
您是否需要采集厚样本的（3D）信息？
厚样本对显微镜检查来说是一个挑战。尤其是宽场显微镜在同时照亮整个样本的情况下，来自焦点外区域的额外光会显著减少焦点内的样本特征。
成像解析可以帮助获得没有失焦光的图像。该技术可以应用于单个图像平面以获得即时结果（ICC：即时成像解析），或者可以与额外的反卷积步骤（SVCC：小容量成像解析；LVCC：大容量成像解析）以获得更好的结果。反卷积将光子信息重新分配给它们的起源，从而在焦平面中提供更好的所需结构对比度。与传统的宽场图像相比，这可以让用户更容易地将感兴趣的结构与背景区分开来。
 

图5：癌组织中的单分子RNA-FISH。RNA-01（绿色）、RNA-02（品红色）左：原始数据。中：使用即时成像解析。右图：大容量成像解析之后。由苏黎世大学（瑞士）的Andreas Moor教授提供。
 
您想在显微镜上操作细胞吗？
在过去的几年里，样本的图像处理变得日益普遍。这意味着研究人员不仅要观察活细胞，还要借助光来操纵它们。光漂白后的荧光恢复（FRAP）是有助于了解动态细胞过程的一个示例。对于这些类型的操作技术，通常需要额外的光源，这些光源必须集成到显微镜的光路中。
这种方法并非易事。徕卡无限端口是一种通用解决方案，可将附加光源耦合到显微镜的光路中，而不会影响图像质量，例如：FRAP、光开关、消融或光遗传学。有了合适的适配器，研究人员甚至可以连接他们的自制设备。
 
 
图6：徕卡WFFRAP模块（左侧黑框）可通过无限端口与倒置研究显微镜徕卡DMi8连接。
 
您的预算是多少？
一个重要的问题是您可以投入的资金。一些显微镜供应商提供适合特殊应用的预定义配置。但是，如果您不需要所有付费的预配置组件怎么办？这就是为什么免费配置组件比购买预定义的显微镜系统更经济的原因。
此外，对显微镜的要求可能会随着时间而改变。在这种情况下，可升级系统具有一定的优势。通过预定义和固定的配置，您会发现仅需有限数量的应用程序。可升级性让您可以根据不断变化的需求灵活配置。
考虑到这些因素，徕卡DMi8等模块化显微镜平台可以使研究人员从经济的显微镜系统入门，然后随着需求的增长而不断升级。
 
 
图7：利用模块化设计，徕卡DMi8可以根据研究人员的需要进行配置。此外，如果需求发生变化，后期还可以进行升级。
 
谁使用显微镜？
显微镜用户的范围可能差异很大。尤其是在大学，用户可能非常有经验，也可能是绝对的初学者。因此，由徕卡应用套件X(LAS X)等直观软件运行的易于使用的显微镜系统有助于人们快速入门并快速获取数据。例如，面向工作流的设计、图像分析向导以及将外围设备无缝集成到系统中可以简化您的工作。
除了宽场研究显微镜外，体视显微镜也经常用于生命科学研究实验室。您可以在“选择体视显微镜时要考虑的因素”一文中了解更多信息。
 

了解更多：徕卡显微