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精确三维定位,实现EM成像——掌握精髓

发布时间:2022-11-29      点击次数:262

使用简化的Coral Cryo电子断层扫描工作流程确保成功

低温电子断层扫描(CryoET)是一种成像技术,可以让研究人员以亚纳米分辨率观察蛋白质和其他大生物分子。了解分子的形状和结构,包括口袋和裂隙,可以帮助研究人员设计能够像拼图一样附着于分子的药物。低温ET成像也因此成为了解和治疗疾病和失调的重要基础。

了解徕卡显微系统的无缝冷冻电子断层扫描流程Coral Cryo如何使用共聚焦超分辨率更精确地定位您的意向结构。利用该工作流程,您可以可靠地快速部署实验,实现更好的可重复性、灵活性,并提高最终结果的准确性。

冷冻电子断层扫描(CryoET)

使用了冷冻电子断层扫描(Cryo TEM),将在细胞环境内观察生物分子的分辨率提升到了1nm,达到了qian suo wei you的精度。通过这种方式,可以仅通过其形状来识别单个蛋白质,而且无需任何标记,甚至可以区分不同的构象,帮助深入理解分子社会学。

CryoET成像为理解空间蛋白质结构和相互作用提供了一种全新的方法,有助于解读细胞机制并应用这些见解。例如,它们可能有助于开发多种疾病的治疗方法。

但是,亚纳米分辨率的成像存在多种挑战:它的成本高昂,需要大量的培训,涉及许多仪器操作,而且大多数情况下,电子显微镜(EM)无法选择性地显示目标结构。为确保高成功率,在工作流程的光镜(LM)阶段,需要以尽可能高的分辨率识别和定位EM成像的目标体积。

徕卡显微系统的无缝低温电子断层扫描工作流程Coral使用共焦超分辨率进行精确定位。该工作流程不仅减少了样本制备的步骤,还提高了样本装载和转移的成功率,从而提高了On-Grid Lamella/CryoET工作流程的效率。

目标坐标以开放格式提供给后续的FIB研磨和LM-EM关联。因此,您可以实现更高的工作效率和更好的实验可再现性。这可以帮助您加速设施中的方案部署,并提高最终结果的准确性。

精确的三维体积定位

STELLARIS 5低温共聚焦显微镜,包括低温平台和转移梭,是Coral Cryo工作流程中精确定位的核心部分。与宽视场仪器相比,共焦显微镜的Z分辨率更高,在设计上更适合三维定位。

通过在后续的高精度关联中应用超分辨率的数据,STELLARIS 5 Cryo作为一个独立的组件,性能优于使用集成光镜进行定位的EM解决方案,同时也释放了宝贵的EM仪器时间。

使用荧光珠在样本上施加一个基准标记。通过确定它们在三维图像数据中的位置,可以显著提高Z轴上的定位精度。此外,徕卡还开发了一种基于插值的方法,能够以比系统的实际光学分辨率更高的精度找到荧光珠中心(正在申请zhuan li)。

LAS X Coral Cryo:基于插值的三维定位,使用X和Y方向的Z-堆栈的截面。标记可在所有相关窗口中交互移动。


安全完成工作流程的各个阶段

STELLARIS 5 Cryo可结合先进的CryoET定位软件(LAS X Coral Cryo),还可以无缝集成和转移到低温FIB或VCT平台。传统的低温电子断层扫描的工作流程包含多个复杂的步骤,特别容易出错,并经常破坏后续重要的成像步骤。人工准备、处理和转移样本的步骤不仅麻烦、繁琐,还可能导致样本污染或反玻璃化。

Coral Cryo的工作流程改变了这一点。通过简化工作流程,可以实现更广泛的CryoET应用。精简的步骤、高灵活性和安全性,可确保样本的活力、质量检查,实现精确和可靠的三维定位机制。

低温平台是一个更稳定的封闭系统,更容易操作,且无需从平台上取下冷却插件。样本转移梭的装载过程简单,可将样本损失的风险降至zui di,并促进沿仪器平台的转移。

STELLARIS 5 Cryo可结合先进的冷冻电子断层扫描定位软件 (LAS X Coral Cryo),并与冷冻FIB或VCT阶段的各种无缝集成和传输选件结合使用。

 Clamydomonas TauSense比例尺10µm

Coral Cryo - 工作原理

集成解决方案的优势

如果没有准确的目标位置,片状目标区域的方法通常是一种耗时的迭代方法。与集成 LM-EM版本相比,使用Coral Cryo工作流程和STELLARIS 5 Cryo共聚焦显微镜可以通过共聚焦技术提供更高的分辨率,更好的图像质量和更高的Z分辨率。Coral Cryo为精确检测目标荧光提供了光谱灵活性,我们du te的TauSense技术

以消除不需要的自发荧光,并对目标识别进行微调,在进入EM阶段之前可以预先检查。

用TauSense成像工具检查硅藻。光谱-500-640 nm光谱带的强度图像。TauContrast-Look-up-table表示光子的平均到达时间;短的到达时间为蓝色,长的到达时间由黄色过渡到红色。显示了不同的结构。TauSeparation-T光谱成分被分离,成分1显示叶绿体的自发荧光,0.1 ns;成分2显示纯净的LifeAct-GFP信号,平均到达时间2.7 ns。样本由德国TU Dresden,B CUBE的Nicole Poulsen提供。


灵活性

Coral Cryo提供两种不同的工作流程解决方案,为低温FIB显微镜提供高灵活性。通过我们灵活的工作流程,我们的低温传输系统EMVCT可以连接市场上所有的低温FIB 解决方案,为您提供Coral Cryo工作流程的所有优势。对于Thermo Scientific Aquilos的用户,我们提供集成解决方案,通过将我们的样本盒与Aquilo低温FIB 的硬件整合,进一步减少工作流程的步骤。

精简的端到端Coral Cryo工作流程提供了明确的步骤、模块和无缝的硬件和软件接口。由于无缝的硬件和软件接口,Coral Cryo可以快速部署在您的设施或实验室。

荧光结构的三维定位用于冷冻电子断层扫描

 

荧光结构的三维定位用于冷冻电子断层扫描。薄片转移到低温TEM上。由德国Martinsried的Max-Planck生物化学研究所的Anna Bieber和Cristina Capitanio友情提供;Stem由Florian Wilfling提供。

通过超分辨率的低温共聚焦显微镜识别荧光结构。使用样本周围的珠子作为相关标记,可以在低温FIB-SEM上识别目标结构,并从细胞体积中磨出含有目标结构的薄片。薄片被转移到低温TEM上,记录薄片的倾斜系列。从倾斜系列中可以计算出三维体积,其分辨率可达亚纳米级,并为可视化和分析创建一个渲染图。

· A - 共聚焦三维体积的最大强度投影。目标结构(表达Ede1-eGFP的酵母细胞,参与凝集素介导的内吞作用)由一个箭头描述出来。

· B - FIB研磨后的TEM中的FIB片层,叠加Ede1-eGFP的荧光。

· C - 片层体积断层图的示例性图像。正方形表示图像D的位置。

· D-断层图的细节,描绘了相分离的内细胞蛋白沉积。

比例尺:A - 内部网格方块的宽度。90μm,条宽:35 µm.B, C, D - 插入物的边缘长度为2微米。

LNG-non-LNGHeLa细胞标记色:深蓝色-Hoechst,细胞核;绿色-MitoTracker Green,线粒体;红色-Bodipy,脂质滴。白色-珠子,反射模式-网格条。细胞由德国海德堡欧洲分子生物学实验室(EMBL)Mahamid Group的Ievgeniia Zagoriy友情提供。


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