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学习如何从共聚焦图像中去除自发荧光

发布时间:2022-12-12      点击次数:275

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自发荧光

了解自发荧光的常见原因,以及如何从您的共聚焦显微镜成像过程中去除它根据您的应用,可能有任意数量的自发荧光来源,但幸运的是,解决方案同样也多种多样——从改变您的介质到使用荧光寿命成像和远红区染料。








引言

荧光显微镜已经che di改变了我们对生物学的理解。通过以高空间分辨率定位细胞内特定分子事件,人们对从基因表达途径到药物相互作用的各个方面有了深入的了解。

随着现代共聚焦显微镜技术的改进,其灵敏度也在提高。在共聚焦成像过程中,一个关键的因素是信噪比,背景噪音会掩盖信号的微小变化。

在共聚焦显微镜中,噪音的最大来源之一是自发荧光。去除这种背景对于理解样品中存在的信号的微小差异至关重要。在这篇综述中,我们将探讨如何通过一些快速修复方法和一些现代技术去除自发荧光,如荧光寿命成像。借助软件和显微镜硬件方面的进步,这些技术越来越容易使用。

自发荧光的原因

自发荧光有许多潜在的原因,在一个样品中往往有多个来源。首先,细胞制剂本身可以是内源性自发荧光的来源。一些常见的来源是NADH、黄素、脂褐素、胶原蛋白和弹性蛋白,以及植物样品中的叶绿素和木质素。换句话说,它们是很难消除的。

除了细胞增加了自发荧光外,在成像前处理样品的方式也会引入额外的背景荧光。从处理试剂到封片介质,这可能是任何东西。在去除自发荧光之前,找到自发荧光的来源是很重要的。

消除自发荧光的方法

了解您的样品

如果您遇到自发荧光的问题,首先要做的是通过调查样品来尝试确定原因。当您开始实验时,先选择一个未标记的对照品,以确定染色过程中是否有增加背景荧光。

了解您的自发荧光的光谱也很重要。这可以通过光谱扫描来确定。光谱扫描将有助于实验优化和避免自发荧光的峰值。

优化荧标记

一旦您了解了自发荧光的光谱,下一个阶段就是优化荧光标记选择。如果自发荧光的光谱和您的荧光标记的光谱高度重叠,那么您的信号很有可能会被自发荧光所掩盖。在这种情况下,选择一个光谱远离背景自发荧光的荧光标记。例如,如果您的自发荧光是在光谱的蓝色区域,将您的荧光标记移到绿色或红色区域。

选择荧光团时,选择新型探针,如Alexa Fluor、Dylight或Atto。这些染料往往更亮,更稳定,并且激发和发射带更窄,可以更容易地选择您的荧光标记的信号。如果您的显微镜能检测到它们,远红区染料是避免自发荧光问题的有效方法,因为这些波长在生物样品中很少出现。检测到远红染料还有一个好处,就是能够扩大用于多色实验的通道数量。

选择荧光标记后,重要的是不要盲目地用说明书上列出的浓度进行实验。更多的时候,需要对荧光团进行滴定,在您的样品上测试不同的浓度。这可以让您看到哪种浓度能更有效地与背景区分,并减少自发荧光产生的干扰。按照制造商的说明,创建一个荧光标记的稀释梯度,以涵盖略低于和略高于推荐用量的范围。用您的样品测试这些稀释液,以确定哪种稀释液会给您带来zui you xiao的信号。

优化您的显微镜设置

共聚焦显微镜的设置对图像中的可见信号发挥着重要的作用,包括自发荧光。利用这些设置的优势,通过调整光谱检测,尽可能多地切断自发荧光信号。根据显微镜的不同,有不同的方法,但最灵活的选择是选择一个白激光与光谱检测器相配合。这样,您可以精确调整到达样品的光的波长,以及通过检测器的波长。通过这种方式,在选择哪些信号被记录在捕获的图像中时,可以进行非常精细的控制,并有足够的机会消除自发荧光

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图1:当比较自发荧光和荧光标记的光谱时,挑选一个与自发荧光信号不重叠的荧光标记。

处理您的样品以避免自发荧光

通常自发荧光不是来自样品,而是来自成像前的处理方式。例如,封片介质、组织培养基和实验室器皿都可能是自发荧光的来源。

如果您正在进行活细胞成像实验,那么考虑在成像前用预热的不含酚红的培养基或透明的缓冲盐水代替正常的培养基。除了pH指示剂酚红(在440纳米处被激发时具有高强度荧光)外,培养基和试剂(如FBS)可能含有许多蛋白质和小分子,它们本身具有荧光信号--如果不去除它们,所有这些都会造成强烈的自发荧光背景。如果您决定将您的细胞换成一种新的培养基进行活体成像,重要的是要注意这可能会引起细胞行为和表型的意外变化,所以根据您的研究内容,您可能需要先让细胞适应新的培养基。

您也可以测量一下您用同一显微镜设置的器皿的自发荧光,查看是否是自发荧光的来源。测量时,请尝试使用带玻璃底的培养皿或专门用于去除自发荧光信号的玻璃底皿进行成像。

在对暴露于化学品的活检和组织样本进行成像时也会出现类似的问题。一个常见的例子是消化道,如果它被暴露在抗生素(如四环素)中,会有大量的自发荧光,这些抗生素有强烈的荧光特征。在这种情况下,通过用缓冲盐水che di冲洗或谨慎使用溶剂,可以很容易去除荧光。

如果您要固定细胞,固定方法会对自发荧光有很大影响。考虑用福尔马林和戊二醛的替代品,并且在成像前尽量不要将固定的样品存放太久,因为自发荧光会随着时间的推移而增加

软 件

虽然zui li xiang的方式是通过实验设计消除自发荧光,但有些时候这是无法实现的。在这些情况下,可以通过计算来解决您的自发荧光问题。使用您的显微镜软件或开源解决方案,如ImageJ,可以分析含有自发荧光的像素,并尝试从整个图像中消除自发荧光[1]。但要注意的是,计算方法可能很复杂。有许多不同的方法和算法可供选择,所以可以尝试查看哪些方法xiao guo zui hao。重要的是要记住,这些方法往往会降低您的荧光体信号的强度以及自发荧光,所以要小心使用它们,并注意在提高与背景的对比度和降低信号强度之间进行权衡。

固定后去除自发荧光

准备好您的样品并储存在冰箱后,似乎任何自发荧光都会留在那里。虽然在样品准备阶段消除自发荧光比较容易,但即使在这个过程的后期阶段也肯定可以采取一些步骤。

有许多化学处理方法可以减弱自发荧光信号。其中一些是市面上可以买到的,而另一些则可以用普通的实验室化学品轻松制备,如peng qing hua na、苏丹黑B、乙醇铵等[2,3]

光漂白在显微镜中往往有负面的含义,在激光调得稍高的情况下,往往会在花费大量时间寻找最佳图像后失去荧光信号。然而,对于自发荧光,漂白可以发挥有益的帮助。在添加荧光团之前,您可以用高强度LED光处理您的样品,以漂白所有的背景自发荧。之后,您所选择的荧光标记应该与漂白后的背景形成更强烈的对比[4]

消除自发荧光的先进方法

显微镜和荧光标记技术在不断进步的同时也考虑到了自发荧光。有两项创新在商业共聚焦显微镜中正变得越来越容易使用。

白光激

在减少自发荧光方面,白激光(WLL)具有很大的灵活性。首先,它们使您能够精细地调整激发波长,以匹配您所选择的荧光团,同时补充您的样品的自发荧光特征。

白激光在选择荧光团时也给您大的灵活性,因为理论上它们可以让您在整个光谱范围内使用所有已知的荧光染料。波长从440 nm一直到远红端(790 nm),在处理自发荧光时,激发新型远红荧光标记的能力特别有利,因为自发荧光更常见于光谱的蓝色和绿色带。

最后,基于光纤的WLL技术能够实现脉冲激发,因此,您可以在脉冲之间的非常短的间隔内记录荧光信号(计数光子)。这是时间相关单光子计数(TCSPC)的一个基本要求--荧光寿命分析的黄金标准方法。有了WLL,FLIM可以内置于您的显微镜中,为减少自发荧光和提高图像对比度提供了一个非常有效和相对简单的方法

寿命成像

荧光寿命成像方法可用于消除自发荧光。寿命测量不是仅仅依靠特定波长下的荧光强度,而是反映荧光团在激发状态下所花费的时间,这通常是纳秒级的时间。这可以发挥重要的作用,因为您的背景自发荧光和您的荧光标记有重叠光谱的几率相对较高。然而,它们具有相同的寿命信号的几率要小得多。这意味着寿命测量可以用来区分自发荧光和荧光标记信号,即使它们看起来在同一光谱范围内。以这种方式区分荧光信号,意味着使用寿命测量可以从几乎任何荧光信号中收集有意义的信息,甚至是自发荧光。虽然寿命测量在传统上是一种相对复杂的技术,但硬件和软件的改进使其更容易被纳入任何共聚焦显微镜的工作流程

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图2:左边的荧光显微镜图像,没有区分荧光信号和背景自发荧光。右边的图像使用FLIM来区分叶绿体中的自发荧光(蓝色)和来自细胞膜的理想荧光信号(绿色)。


概述和结论

自发荧光不一定会毁掉您的实验

但当您只有有限数量的珍贵样本时,应确保没有任何东西会损害您的实验数据的质量。自发荧光是一种足以破坏您实验的常见现象。然而,从简单地替换您在样品中使用的介质一直到使用先进的显微镜和检测器,有许多种方法可以解决自发荧光

针对自发荧光做好相关准备是防止它影响您的实验的最好方法。通过采取相关的应对措施,您可以在实验设计中做出选择,减少或wan quan消除背景荧光。


参考文献

1,J. M. Powell, N. W. Plummer, E. L. Scappini, C. J. Tucker and a. P. Jensen, „DEFiNE: A Method for Enhancement and Quantification of Fluorescently Labeled Axons,“ Front Neuroanat, 2018.

2,W. Baschong, R. Suetterlin and R. Laeng, „Control of autofluorescence of archival formaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue in confocal laser scanning microscopy (CLSM).,“ J Histochem Cytochem, vol. 49, no. 12, 2001.

3,M. Viegas, T. Martins, F. Seco and A. do Carmo, „An improved and cost-effective methodology for the reduction of autofluorescence in direct immunofluorescence studies on formalin-fixed paraffin-embedded tissues.,“ Eur J Histochem, vol. 51, no. 1, 2007.

4,S. Y, I. P and C. A, „Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy.,“ J Vis Exp, no. 127, 2017.






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