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用SRS显微镜对配方产品进行表征分析

更新时间:2023-02-14      点击次数:490

成分定位和皮肤渗透可视化

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从药品和消费者健康产品到农用化学品和油漆,霜剂、糊剂、凝胶、乳剂和片剂常见于众多制造领域。为提高有效性以及产品性能和安全性,有必要了解产品中各成分之间的相互作用。具备能评估活性成分的结构、稳定性并对其输送进行可视化的技术对配方产品制造业而言具有重大价值。


成分分布可视化



受激拉曼散射(SRS)和相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)可提供具有高空间和时间分辨率的无标记化学信息,因此非常适合用于可视化配方产品的结构,包括监测单一成分在使用期间的所带来的结果(包括在使用期间监测单一组分的命运)。通过选择适当的拉曼位移,可以从预先存在的单个成分的拉曼光谱(图1左),或从获取λ扫描生成的SRS光谱(见下文,以及图3中的示例)进行SRS对比,从而对单一成分进行成像。


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图1:左:在532nm激发下获得的石蜡(红色)和水(蓝色)的自发拉曼光谱。右:用SRS显微镜对商业水乳剂配方进行成像,以显示凡士林油相(红色,2850 cm-1处的CH₂键)vs水相(蓝色,3400 cm-1处的O-H键)。通过简单地将一小滴样品置于两个盖玻片之间,准备进行正向SRS成像。

除了这些对比波数外,还应在附近预期无拉曼强度的波数处获取“非共振"控制图像(见图2中的示例),从而确保检测到的信号基于拉曼光谱,并能识别任何杂散信号,如激光吸收产生的伪影。在各成分/相的所需波数下获得图像后,可将图像合并成一个复合图像,从而了解材料中不同成分之间的关联性。除了SRS对比,还可通过使用二次谐波生成或荧光等方法来同时成像,获得其他结构信息。图2中的图像显示了用SRS显微镜成像的防晒霜样品中油vs水的相位分布,以及用SHG可视化的氧化锌颗粒。

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图2:用SRS和SHG显微镜对防晒霜配方进行成像,用正向SRS显示油相vs水相,用epi-SHG显示氧化锌颗粒分布。



生成SRS光谱以提供化学和结构信息


SRS光谱可通过执行λ扫描来生成,在此期间,SRS图像在泵浦光束的波长上以非常小的增量被捕获,以生成跨越感兴趣波数范围的图像栈。图3显示了在含有多种活性成分的皮肤用药物配方上获得的这种λ扫描图像栈。当泵浦光束扫过与拉曼光谱的指纹区相对应的波长时,不同的成分依次受到激发,因为其波数受到刺激。获得这些图像栈后,可立即选择相关特征来生成感兴趣区域(ROI)。从这些ROI中,通过绘制ROI SRS信号强度和泵浦光束波长(可转换为波数)的关系,生成SRS光谱。有时,为波长堆栈中所有图像生成最大投影有助于在一张图像中实现所有特征的可视化,确保不会遗漏任何重要特征。


皮肤用药物配方的SRS λ扫描图像堆栈。

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图3:左:皮肤用药物配方的SRS λ扫描。从显示的图像栈中创建的最大投影图像,注释描述了ROI。在约2000 cm-1至1000 cm-1的范围内,以泵浦光束的0.1 nm增量获取图像。右:各ROI的SRS光谱根据SRS信号强度和波长绘制而成。

从λ扫描中生成SRS光谱后,可立即将这些光谱与单一成分的自发拉曼光谱进行比较。将光谱信息与图像中的形态信息相结合,对配方的问题分析具有重大价值,如识别是否存在多晶、共晶或氧化产物。



皮肤中成分渗透的可视化


除了分析配方本身的特性外,SRS显微镜也可用于对单一成分使用后带来的最终结果进行可视化。例如,监测化学品在皮肤中的渗透,这在药物输送和化学风险评估中具有极其重要的应用价值。图4显示了4-氰基苯酚给药后皮肤的图像。将组织冷冻切片,用SRS成像,以在2235 cm-1(品红色)处通过腈基官能团的对比来显示这种化合物的分布。在2850 cm-1处使用CH2键振动模式(红色)、在1666 cm-1处采用酰胺I(蓝色)以及使用SHG通道的胶原蛋白分布(绿色),对皮肤结构进行可视化。

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图4:4-氰基苯酚给药后的猪皮肤的正向SRS和Epi-SHG合成图像。在2850 cm-1处使用CH2键振动模式(红色)、在1666 cm-1处采用酰胺I(蓝色)以及使用SHG通道的胶原蛋白分布(绿色),对皮肤结构进行可视化。在2235 cm-1处采用腈基官能团显示4-氰基苯酚的分布(品红色)。*


由于SRS信号与浓度呈线性关系,因此有可能通过图像分析提取某些定量信息,例如,化学物质的相对浓度和皮肤深度。对于在同一共焦平面上成像的物理截面,该操作合理且简单。然而,当对三维标本进行成像时,必须对激光散射和随着深度增加产生的吸收所致的信号损失进行校正。


试图对不含dute化学官能团的化学物质进行成像时,有时很难获得特定的对比度。在这种情况下,对感兴趣的分子进行氘化,可帮助将峰值转移到拉曼光谱的生物“沉默"区域,该区域的组织中几乎无自然存在的信号。这种方法可便于对敏感和化学特异性成分进行可视化,而无需引入会扰乱物理化学特性,从而扰乱药代动力学特征的荧光基团。另外,还可采用多变量数据分析方法,对不同成分进行光谱拆分

致谢

衷心感谢“分析化学信托基金"和“分析测量科学共同体"的支持。

*数据通过与英国巴斯大学的Richard Guy教授小组合作获得。本研究的资金部分由美国食品药品监督管理局资助(1U01FD006533-01)。所有观点不一定反映美国卫生与公众服务部的guanfang政策;提到任何商品名称、商业惯例或组织也不一定获得美国政府的认可。


参考文献:

· Saar BG, Contreras-Rojas LR, Xie XS and Guy RH (2011). Imaging drug delivery to skin with stimulated Raman scattering microscopy. Molecular Pharmaceutics. 8, 969-75.

· Belsey NA, Garrett NL, Contreras-Rojas LR, Pickup-Gerlaugh AJ, Price GJ, Moger J and Guy, RH (2014). Evaluation of drug delivery to intact and porated skin by coherent Raman scattering and fluorescence microscopies. Journal of Controlled Release, 174, 37-42.

· Chiu WS, Belsey NA, Garrett NL, Moger J, Delgado-Charro MB and Guy RH (2015). Molecular diffusion in the human nail measured by stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 112, 7725-7730.

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