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【显微课堂】获得高质量的超薄切片

更新时间:2024-05-31      点击次数:116
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UC Enuity如何帮助您得到厚度一致的超薄切片

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超薄切片是诸多科学领域中的关键技术,其能够将样品制备成厚度均一的薄片,以便进行电子显微镜表征。在超薄切片实验中,切片的稳定性和一致性至关重要,因为它将直接决定研究结果质量和数据准确性。


UC Enuity能够应对这一挑战,提供厚度一致且高质量的切。其用户友好的设计不仅简化了研究过程,还提高了可重复性,使研究者对所得到的结论更有信心。

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简 介


超薄切片是电子显微学的重要技术,能够制备厚度均一的薄片以进行高分辨成像和分析表征。由于超薄切片技术能够在室温和低温条件下精确且灵活地制备样本切片,它已成为生命和材料科学研究中的工具[1-6]。超薄切片帮助科学家精确控制从样本中切取的薄片厚度,这对于制备出满足扫描电子显微镜(SEM)或透射电子显微镜(TEM)成像要求的切片至关重要[1]。薄片切片厚度的范围在TEM测试中一般为50-300纳米,而SEM阵列断层扫描则通常需要低于50纳米的切片[2]。超薄切片所制备的切片质量对各个科学领域实验结果的可靠性和可解释性具有深远影响。因此,确保切片质量的一致性对于得到准确的数据,以及探究实验的科学意义至关重要[1-6]



切片质量一致的重要性

在超薄切片中,切片质量的一致性对于准确进行形态学分析和精确测量至关重要。切片厚度的变化会扭曲细胞结构的尺寸和定量数据,不利于开展对比研究工作[1-6]。同时,它们还会影响下游实验的结果,如免疫标记和光谱分析。均匀的切片可确保目标分子或感兴趣区域的持续暴露,从而优化标记程序的效率和可靠性


确保精确的切片质量,对于提升与超薄切片相结合分析技术的敏感性、特异性和可重复性至关重要。在体积电子显微镜(Volume EM)领域尤为重要,因为其需要使用大量数据来准确重建3D分子结构。这种方法所需的数据通常是从数以百计到数以千计的连续切片中获取的。




结 果


整个切片过程中,使用50纳米、70纳米和100纳米的进给设置选择不同的切片厚度值,切片速度为1毫米/秒。使用超薄切片机在纳米尺度上进行样品切片,在光照下水槽中漂浮的切片会呈现不同的颜色,这是光干涉效应的结果[7]。这种干涉颜色与切片厚度之间的关系提供了一种视觉测量手段[7]。厚度为50纳米的切片呈现银色,而接近100纳米厚度的切片则逐渐呈现金色,而厚度超过100纳米的切片则呈现多种颜色(图1)。透射电子显微镜(TEM)分析通常需要厚度在50纳米(银色)和100纳米(金色)之间的切片。尽管在某些情况下,所需的切片厚度可能会偏离这个范围。切片或条带在水上漂浮时呈现的颜色可以指示其厚度[7]



切片颜色与厚度:范围相关性分析

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图1:显示了切片干涉颜色与厚度之间的关系,厚度范围从10纳米到350纳米。




使用超薄切片机制备的切片条带示例

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图2:图A、B和C分别展示了使用50纳米、70纳米和100纳米进给设置获得的切片条带。图D为图B中切片条带的放大图。

在UC Enuity上,可以通过调整进给步长来改变切片的厚度[1]。然而,切片边缘的质量在很大程度上受到切片速度的影响 [1]。当速度过高时,会导致边缘不锐利,从而降低切片的质量 [1]。因此,必须在进给步长和切片速度之间保持平衡,以获得符合所需质量标准的理想切片 [1]。通常,切片速度为1毫米/秒,这是刀具制造商(瑞士Diatome公司)推荐使用的速度。


图2展示了在切片速度和进给之间取得正确平衡后可以获得的高质量切片

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图3:用于阵列层析成像的三个连续切片条带,每个条带包含30张切片,进给为70纳米。这些条带是使用UC Enuity Volume EM模块制备的。在自动切片得到条带后,UC Enuity在每个条带的末端添加了两张厚度为100纳米的释放厚片。

图3展示了阵列断层成像实验连续切片工作流程的结果。在实验过程中,UC Enuity自动制备多个切片条带,以便稍后在较大的基底(如载玻片或硅片)上收集。图3展示了收集前的切片条带。


基于切片干涉颜色和厚度关系,所有三个切片条带中,总共90张切片的厚度一致。


图4展示了使用进给从30纳米增加到180纳米,所获得的嵌入环氧树脂中的组织切片。由于嵌入的组织样品在200纳米及以上厚度参数下切片效果不佳,因此该系列没有扩展到180纳米以上。该案例展示了UC Enuity的精确度,确保用户能够无缝地设置所需的进给,从而获得不同的目标切片厚度(见图1)。

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图4:在切片过程中,通过增加进给量从30纳米到180纳米获得的实际切片。




结 论

切片质量对于电子显微镜样品制备至关重要。UC Enuity超薄切片机凭借70多年的专业经验,是制备锋利、无失真且厚度一致的切片,以进行电子显微镜分析的重要工具。


UC Enuity因其稳定的切片质量和用户友好的操作脱颖而出,无论是经验丰富的研究人员还是新手都能从中受益。通过提供高质量标准的可重复实验结果,UC Enuity减少了切片过程中经常遇到的问题,从而便于直接比较实验数据。这不仅有助于节省时间和资源,还避免了重复样本制备和图像采集的工作。




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参考文献:(上下滑动查看更多)

1.R. Ranner, J. DeRose, Introduction to Ultramicrotomy: Ultrathin sectioning of biological specimens and materials for microscopy and array tomography (AT), Science Lab (2019) Leica Microsystems.

2.R. Ranner, J. DeRose, High Resolution Array Tomography with Automated Serial Sectioning: Faster 3D imaging of cellular and protein structures, Science Lab (2018) Leica Microsystems. 

3.H. Gnaegi, Ultramicrotomy Techniques for Materials Sectioning: Sectioning of polymer and brittle materials for electron microscopy – free webinar on-demand, Science Lab (2023) Leica Microsystems. 

4.F. Assen, Array Tomography for SEM 3D Reconstruction: Webinar On-Demand - Benefits of automated serial sectioning with the ARTOS 3D ultramicrotome, Science Lab (2018) Leica Microsystems.

5.A. Pinto, Streamline your EM Sample Preparation Workflow for Biological Applications: A guide to electron microscopy sample preparation, Science Lab (2023) Leica Microsystems. 

6.Sitte H. 1981, Ultramicrotomy: Frequent faults and problems. AO/Reichent, Vienna.

7.Toshio SAKAI, Relation between Thickness and Interference Colors of Biological Ultrathin Section, Journal of Electron Microscopy, Volume 29, Issue 4, 1980, Pages 369–375,

8.Koster, A. J., Klumperman, J., & Meijer, E. (2007). Sectioning of immuno-labeled Lowicryl sections for correlative fluorescence and electron microscopy. Nature Protocols, 2(10), 2480-2489.

9.Leduc, C., Si, S., Gautier, R., Gao, J., & Zheng, L. (2013). Advances in electron microscopy for the imaging of viruses. Current Opinion in Virology, 3(1), 47-52.






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