显微课堂 | 利用快速高对比度成像改进斑马鱼-胚胎筛查

利用先进的成像技术提高

斑马鱼胚胎分析的清晰度和速度

本文介绍了带有THUNDER功能的 DM6 B 显微镜如何简化转基因斑马鱼胚胎的筛选，解决传统显微镜分辨率低和焦外模糊的常见问题。高速成像、增强的对比度以及对低蛋白表达成像的灵敏度，确保了准确高效的筛选。其主要功能包括即时计算清除、高灵敏度摄像头和定向照明，是发育生物学的理想之选。

筛选转基因斑马鱼胚胎

转基因斑马鱼胚胎是发育生物学中常用的模式生物 [1]。这些样本通常被设计用于体内容积成像，使用需要特定样本制备的系统，包括光片显微镜 [2]。因此，需要一种快速准确的筛选技术来确定斑马鱼下游光片显微镜成像是否存在适当的蛋白质表达。

斑马鱼筛选通常使用具有荧光成像功能的体视显微镜进行。然而，体视显微镜的局限性在于分辨率和灵敏度较低，这在表达量较低的样本中尤为重要。传统的宽场显微镜是一种高速成像技术，但也存在焦外模糊的问题，尤其是对于包括斑马鱼胚胎在内的较厚样本。这种失焦模糊降低了对比度，而对比度对于斑马鱼的表达可视化至关重要。

配备 THUNDER 的 DM6 B 显微镜是一种用户友好型系统，可通过它进行高速筛选：

• ‍采用新型SynapseTM 系统实现高速触发；

• ‍采用 8 通道 LED 光源，提供柔和而有针对性的照明；

• ‍利用高灵敏度 K8 相机检测低表达蛋白；

• ‍通过 LAS X Navigator 螺旋扫描快速概览扫描，找到最佳转基因斑马鱼；

• THUNDER ICC（实时即时图像增强功能）可提高对比度，清晰显示荧光蛋白。
  
  
  

  图 1：THUNDER Imager Tissue 用于筛选转基因斑马鱼。
  图像由澳大利亚莫纳什大学（Monash University）莫纳什生物医学发现研究所博士生 Laura Kreplin 提供。

  材料和方法

  在此工作流程中，转基因斑马鱼被转移到 35 毫米的培养皿中。不过，也有与THUNDER成像系统组织兼容的其他安装平台。

  使用低倍物镜定位培养皿中的斑马鱼胚胎（图 2）。

  LAS-X Navigator用于标记斑马鱼感兴趣的区域（图 3）。

  使用分辨率更高的物镜来确定表达量是否足以进行下游成像。此类物镜包括 HC FLUOTAR L 16x/0,60 IMM CORR VISIR (506533)、HC APO L 63x/0,90 W U-V-I (506148) 和 HC FLUOTAR L 25x/0,95 W VISIR (506374)。低 LED 光强度、K8 Scientific CMOS 摄像机 95% 的峰值 QE 和实时触发相结合，确保在筛选过程中保留内源水平的蛋白质信号（图 4）。
  
  
  
  

图 2：使用 THUNDER Imager Tissue 上的 1.25x/0.04 干式物镜拍摄的斑马鱼胚胎明场图像。比例尺为 1500 µm。
图像由澳大利亚墨尔本莫纳什大学（Monash University）莫纳什生物医学发现研究所 Dr. Senthil Arumugam 和博士生 Laura Kreplin 提供。

图 3：使用 LAS X Navigator 发现的斑马鱼胚胎，并标记用于荧光筛选。

图像由澳大利亚墨尔本莫纳什大学（Monash University）莫纳什生物医学发现研究所 Dr. Senthil Arumugam 和博士生 Laura Kreplin 提供。

图 4：
A) 使用 16x/0.6 浸没式下浸物镜的 THUNDER Imager Tissue 配置。
B) 采用 THUNDER 实时即时计算清除成像（live instant computational clearing）获得的斑马鱼胚胎图像。成像 mKate 表达时，使用 LED 8 的 555 nm 激发线，在 2% 激发强度和 150 ms 曝光时间下获取图像。比例尺为 300 µm。
图像由澳大利亚墨尔本莫纳什大学（Monash University）莫纳什生物医学发现研究所 Dr. Senthil Arumugam 和博士生 Laura Kreplin 提供。

结论：

选择具有适当转基因能力的斑马鱼胚胎进行下游实验，包括光片成像。DM6 B 配备了THUNDER技术，具有高速成像能力，而且对比度和灵敏度都有所提高，可用于成像低表达蛋白，有助于确保筛查结果的准确性和高效性。这项研究表明，DM6 B 和THUNDER技术可以帮助人们更好地理解发育生物学和其他相关领域的现象。

参考文献：

1. Veldman, M. B.; Lin, S. 《斑马鱼作为儿科研究的发育模式生物》。儿科研究》，2008 年，64（5），470-476 页。

2. Oates, A. C.; Naganathan, S. R. 从斑马鱼胚胎制备单节段外植体。JoVE 2022，第184期，e63196。

3. YouTube 采访莫纳什生物医学发现研究所：研究生命系统& 利用显微镜观察动态过程

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