高质量RNA精准分选如何实现？——汪艳教授团队徕卡激光显微切割(LMD)应用经验分享

您是否遇到这些难题？

1. 固定组织（PFA）无法提取高质量RNA？

2. 样本异质性强，结果不准确、不可靠？

3. 单细胞/空间转录组成本高、分辨率受限？

4. 珍贵病理样本有限，不足够开展多个实验？

例如在肝脏等复杂组织研究中提取RNA分析面临以下挑战：

组织异质性严重：肝脏包含肝细胞、胆管上皮、免疫细胞等，传统整体提取难以反映真实表达差异

空间信息丢失：单细胞测序需组织解离，破坏细胞原位信息

技术方案受限：空间转录组：图像分辨率或通量受限；传统 LCM（Laser Capture Microdissection，激光捕获显微切割）大多使用新鲜样本，无法利用大量病理固定组织

病理固定组织RNA难以提取，降解快，缺乏标准化流程

临床样本珍贵：无法转化为高质量和足够的RNA分析数据。

激光显微切割，即LMD（Laser Microdissection）技术，精准从组织切片中分离目标单细胞 / 特定组织区域，适配后续核酸提取测序。南方医科大学汪艳教授团队发表于Journal of Visualized Experiments的工作中，第一作者曾伟兰博士作为方法学核心执行人，依托学校科研支持中心（中心实验室）平台及该平台配备的徕卡LMD激光显微切割系统，成功构建了一套从固定组织到RNA测序的标准化解决方案，实现精准到单细胞级别分选，兼容PFA固定+冰冻切片样本，5天内完成从取材到测序建库，1000个细胞即可获得高质量RNA分析结果的实践方案。该方案提供了一套完整可重复的标准化实验流程：样本制备 → LMD 精准切割 → RNA提取 → qPCR / RNA-seq。

真正实现：固定组织 → 精准分选 → 高通量分子分析

关键技术突破

01、固定组织RNA提取优化

控制PFA固定时间24h，避免蛋白-核酸过度交联不可逆损伤RNA

优化解交联 + 蛋白酶K消化体系，提高RNA释放效率

RNase全流程控制，保障RNA稳定性

02、高效LMD取样策略

快速苏木素染色替代复杂免疫染色

单张切片30–60min内完成切割，全部切割4h内结束，高效完成目标采集

精准圈选目标细胞群，避免污染

03、微量样本高质量输出

1000 cells → \~110 ng RNA

A260/A280：1.9–2.1

文库片段：300–500 bp（符合测序要求）

该方案从临床到科研全面释放样本价值：

肝病机制研究（MASH、肝损伤、纤维化等）

特定细胞群表达谱分析

微环境与免疫细胞研究

固定病理样本回顾性研究

为什么选择徕卡LMD激光显微切割系统

高精度激光切割，细胞级分辨率

参数可控，适配不同组织类型

可在空间背景下通过可视化控制，实现纯净、无接触、无污染的样本采集

具备高通量处理能力，适应下游质谱等分析需求

样本采集使用标准耗材，通用方便

LMD激光显微切割系统不仅是一台激光显微切割显微镜，更是一套完整DVP解决方案，将细胞显微结构与分子连接，打开病理样本高价值再利用的可能。

汪艳教授团队优化的LMD显微切割步骤：

本流程参考了既往文献的LMD通用操作规范，并针对固定组织中RNA易降解的特性，进行了优化调整。

1.用去除RNase试剂擦拭实验台面与仪器表面。

2.开启LMD控制器，等待显微镜完成初始化。

3.拧动激光器钥匙至开机档位，启动LMD激光系统。激光预热10分钟。

4.打开电脑及LMD软件，等待软件初始化结束。

5.将0.2mL PCR管装入收集装置。

6.在PCR管盖中加入10μL RNA提取缓冲液（RNeasy FFPE 试剂盒配套试剂）。

7.将收集装置装回显微镜。

8.在LMD收集设备设置界面，点击 “移至参考点"，调节相机焦距使参考点成像清晰，必要时通过方向按键将参考点调至视野中央，进行收集设备位置校准。

9.组织切片面向下、标签朝右装入标本夹。

10.选用10倍物镜定位样本区域，进入激光菜单点击校准，弹窗选择确认。

11.设置激光参数（供参考）：Power 50、Aperture 5、Speed 9。

12.工具栏圈选目标区域，选择单一图形，点击开始切割；组织粘连无法自动掉落时，可选用手动裁切模式。警示：操作中禁止直视激光束，防止辐射损伤。

13.可通过软件菜单保存切割前后镜下画面。

14.收集足量细胞后卸下收集组件，再次向管盖补加提取缓冲液至终体积10μL，密封PCR管。

15.充分涡旋混匀收集管。

16.短暂离心，样品- 80℃保存待用。后续样本重复5～16步，切割结束可暂停实验，待统一提取RNA。

注意：单张玻片样品显微切割用时控制在30分钟～1小时，全部切割操作建议4小时内完成。

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