大组织样品原位冷冻电镜断层成像样品制备流程｜北大团队打通组织cryo-ET瓶颈，实现胰岛β细胞原位分子观测

冷冻电镜断层成像（cryo-ET）能在细胞原生环境解析三维分子结构，但大组织、多细胞样本前处理长期是行业难点。2023年北京大学郭强团队在Journal of Structural Biology提出了一套全商用设备适配的高效组织cryo-FIB制样流程；以小鼠胰岛为模型，测出胞内原生胰岛素晶体晶格参数，实现组织原位高分辨结构解析，为厚组织样本原位分子电镜研究提供标准化方案。

一、组织cryo-ET难在哪？

1、cryo-ET核心优势与天然局限

单颗粒冷冻电镜需要纯化蛋白，会破坏细胞内天然分子互作；cryo-ET无需分离组分，可直接解析细胞三维原位分子架构。

但受限于电子束的穿透能力，冷冻透射电镜（cryo-TEM）要求样品厚度控制300 nm以内，但绝大多数完整细胞和组织切片而言，必须通过冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）或冷冻超薄切片机（Leica EM FC7/UC Enuity）减薄，制备出电子透明薄片（lamella）。

2、当前组织制样的三大痛点

1.高压冷冻保护/填充剂干扰

传统高压冷冻用十六烯作为冷冻填充剂，样品被厚保护层包裹，难以定位目标组织区域；改用2-甲基戊烷的方案需真空升华30分钟，且残留培养液会显著降低制样成功率。

2.传统提取工艺耗时且门槛高

传统的商用夹持式机械手提取单块薄片效率低下、通量受限，且高度依赖定制原型设备，难以在普通实验室普及。

3.组织与单细胞体系差异巨大

悬浮细胞和细胞系的FIB减薄流程无法直接适配多层致密组织；目前，行业内仍缺乏一套模块化、标准化且具备高度可落地性的完整制样流水线。

总体而言，现有的组织制样方法多停留在理论方案阶段，缺乏经过完整优化和实测验证的标准化流水线。建立一套高效、稳定、可落地的完整工作流，正是本研究的核心突破口。

二、全新大组织样品制备工作流

大组织样品制备工作流全流程均基于成熟的商用设备搭建无需依赖定制仪器，从而显著降低了技术门槛并提升了方法的可重复性。该流程有效兼顾了制备效率与成功率，单块薄片平均耗时仅为3小时，提取成功率高达90%。该工作流主要包含以下三大核心步骤：

步骤1：组织目标区域精准分离（两种可选方案，图1a）

精准分离胰岛组织（二选一）

酶解法：胶原酶消化胰腺，批量获取 80–200μm 胰岛团；

激光显微切割：切片后精准截取 100×100μm 目标区域，适配复杂异质性组织。

步骤2：改良无包埋高压冷冻（HPF），2 分钟快速去除冷冻填充剂  （图1b）

传统方案痛点：冷冻填充剂包裹组织，遮挡目标区域、后续修块步骤繁琐。

本工作改良方案：

1.以2-甲基戊烷作为冷冻填充剂，将组织直接铺于电镜载网（EM grid）完成高压冷冻；

2.冷冻后将样品夹具浸入-170℃乙烷-丙烷混合液，仅需2 min即可溶解去除2-甲基戊烷，无需长时间真空升华；

3.残留培养液/培养基可充当天然保护剂，对操作容错率更高。

不足：2-甲基戊烷可轻微穿透细胞膜，样品最表层细胞会出现轻微结构损伤，但组织内部细胞超微结构完整，不影响核心观测。

步骤3：冷冻FIB提取（lift-out）超薄薄片制备，自研钼半载网大幅提升稳定性（ 图1c）

全文创新核心，摒弃传统夹持机械手，采用低温探针+再沉积粘接法，同时，搭配实验室自研钼材质半载网，不仅制定了完整的标准化操作规范，更大幅提升了薄片（lamella）在提取过程中的机械稳定性。

图1：多细胞冷冻电子断层扫描样品制备流程示意图

三、工作流实测结果：小鼠胰岛原位分子级成像，多项发现

采用此方法，研究者对小鼠胰岛进行冷冻电镜原位结构观察，实现了β细胞胰岛素晶体的原位分析（图2）。研究者观察到三种不同类型的囊泡，分别为棒状晶体囊泡(图 2h)，未成熟胰岛素晶体囊泡(图 2i)以及成熟的胰岛素晶体囊泡(图2j)，并对囊泡的数量与位置分布进行了统计(图2a，2k)。分析结果表明成熟的胰岛素晶体囊泡占97%，且不同类型的胰岛素囊泡分布无明显特征。而此前使用单细胞体系研究发现不同成熟状态的胰岛素囊泡呈现有组织的空间分布，说明了组织等多细胞原位结构研究的必要性

图2：胰岛β细胞的原位结构

通过对此流程所收集的数据进行深入分析(图3)，确定了胰岛素的晶胞参数（图 3c-f）。其与体外观察到的六方晶体的结构差异则表明细胞内生理条件对晶体堆积的潜在影响。

图3：胰岛素晶体原位晶胞参数测定（a）胰岛β细胞内代表性断层扫描图像的横截面。（b）图(a)中所示的断层扫描图像的3D渲染。前位迁移核糖体（青色）和后位迁移的核糖体（黄色）、胰岛素囊泡（蓝色）、内质网（ER）（橙色）和线粒体（深绿色），通过断层扫描平均计算确定了核糖体。核糖体在原始位置和取向上进行了映射，通过亚断层扫描平均计算确定核糖体的位置和取向。（c,e）胰岛素晶体晶格结构。(g)从9个断层图像中获得的3795个核糖体在分类和优化后形成了两种不同的构象：前移态（青色）和后移态（黄色）。(h)两种构象首先与大亚基对齐，仅小亚基以表面模型形式显示。星号标示了明显的棘轮结构。(i) 两种核糖体结构的傅里叶壳相关曲线在使用0.143作为截止值时，显示出16 Å的分辨率。

四、总结

组织样品前处理是限制cryo-ET走向生物医学常规研究的核心瓶颈。北京大学郭强团队搭建的模块化多细胞组织cryo-ET制样工作流，通过改良无包埋高压冷冻、优化低温探针提取工艺及配套刚性钼半载网，在商用设备体系下实现高效、稳定、大视野的组织超薄薄片制备。

研究以胰岛β细胞为范例，不仅直观证明组织原位观测相比细胞系的独特生物学信息，更解析原生环境胰岛素晶体结构，为糖尿病相关分泌机制、各类器官组织原位分子结构研究提供了一套可直接重复的标准化实验方案，大幅降低了组织冷冻电镜断层成像的实验门槛。

通讯作者介绍：

郭强，现任北京大学生命科学学院研究员，北大-清华生命科学联合中心研究员。他专注于原位结构生物学研究，其团队以冷冻光电联用（CLEM）和冷冻电子断层扫描（cryo-ET）为核心技术，致力于在近生理条件下对亚细胞结构进行高分辨率三维成像，旨在从“细胞建筑学"（亚细胞结构如何构建功能细胞）和“生物大分子社会学"（大分子与细胞器间的相互关系）两个层面，揭示生命活动的基本规律。他曾获多项重要荣誉，包括2024年北京市杰出青年科学基金、2021年拜耳学者和博雅青年学者等。

文章使用Leica EM ICE多功能高压冷冻仪可实现200μm厚组织无冰晶玻璃化固定，兼容各类电镜载网，适配大组织样品原位冷冻电镜断层成像整套实验流程。

Leica EM ICE高压冷冻仪

参考文献：

1.Yichun Wu. Changdong Qin. Wenjing Du. Zhenxi Guo. Liangyi Chen. Qiang Guo. (2023). A practical multicellular sample preparation pipeline broadens the application of in situ cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology .215(3): 107971.