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庞一烜
徕卡电镜制样应用工程师
徕卡电镜制样应用工程师。深耕电镜制样与分析，服务领域横跨材料（地质、高分子、新能源、半导体）与生物（蛋白、细胞、组织），理论基础扎实，实践经验丰富。
“WAFFLE METHOD"与高压冷冻
冷冻电子断层扫描（cryo-ET）在获取生物样品的近原生状态方面高度依赖高压冷冻（HPF）技术。尤其是在处理厚度较大或结构复杂的标本时，若使用投入冷冻固定，则只能将样品玻璃化厚度限制在约5-10 μm，而HPF固定能够迅速将厚度约200 µm的样品玻璃化，截留生物样品原生超微结构的同时不形成冰晶。遗憾的是，传统HPF获得的玻璃化样品块体积过大，对于直接成像来说过厚，必须在多个维度上小心减薄——通常通过冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）铣削——制成电子透明薄片，然后才能进行cryo-ET。这一步既技术要求高又耗时。
对此，一种基于HPF，名为“华夫饼法（WAFFLE METHOD）"的策略应运而生。该方法通过优化冷冻制样环节，大幅度降低后续cryo-FIB操作难度和时长，越发受到科研工作者的关注。该方法最先由McDonald等人在2010年为其奠定基础，并在2015年由Mahamid等人进一步调整，第一次将载网作为HPF铜盘组件之间的样品载体。随后，Kelley等人在2022年的一项研究中正式采用了 “WAFFLE METHOD"这一术语，并对其进行标准化，扩展应用到各种生物样品的高压冷冻固定。现在，越来越多的科研工作者还将“低温光电联用技术（cryo-CLEM）"纳入到此工作流程中，在FIB铣削前使用低温光镜（如Leica EM CORAL CRYO低温共聚焦显微镜）锁定ROI，进一步提高cryo-FIB环节的准确率和通量。
图1. 投入冷冻和高压冷冻固定小立碗藓细胞效果对比。a，投入冷冻固定。最终获得的样品薄片出现明显的冰晶损伤。冰晶损伤部分被标记星号（*）。b,c，高压冷冻固定。样品分别通过“WAFFLE METHOD"和传统高压冷冻套件制备（b）和（c）。使用高压冷冻固定的样品，透射电镜下未显示出非玻璃化迹象。在（a）-（c）中，使用蓝色五边形标记出样品在不同设备间转移过程中引入的冰晶。Pöge Matthias et al. (2025).
相较于直接将样品放入上样套件的标准HPF操作而言，在该方法是将样品置于一个碳支持膜朝下的载网上（如图2所示），以便载网内在HPF固定后会形成一个厚度约为20-30 µm的玻璃化样品层，而非常规的100-200 µm厚度，从而大幅减少FIB铣削磨蚀的玻璃化冰量。且在FIB挖槽铣削过程中，载网的网格天然可为其内样品提供稳定的机械支持，进一步提高制备约200 nm样品薄片的成功率。此外，载网还能直接安装在冷冻透射电镜样品夹上，规避样品薄片在复杂转移中掉落或污染的风险。总体而言，“华夫饼法"简化制样进程的同时提高了断层扫描数据质量，日益成为cryo-ET研究领域策略。
图2：使用“WAFFLE METHOD"的经典上样套件组装示意图。
为一次成功的“WAFFLE METHOD"准备：
在实操中，想要成功复现“WAFFLE METHOD"并非只是按照“食谱"顺序直接组装B盘、样品和载网即可。要想获得均匀自然无机械损伤的制样效果，并使脆弱的“华夫饼"从B盘组装套件中顺利取出，就要在HPF前要分别让载网和B盘做好充分准备。
1
载网：
双面亲水化：
为使样品在载网上铺展成均匀的薄液膜，我们在冷冻固定前，通常会对载网直接接触样品的一面亲水化。但在“WAFFLE METHOD"工作流中，样品在HPF固定后还要经历多设备间转移、cryo-FIB挖槽减薄等复杂操作。为进一步提升载网在全流程中的稳定性，可在套件组装阶段，在载网和底层B盘间滴加少量样品悬液或冷冻保护剂， 使这层液膜在HPF后转化成薄玻璃化冰层，为载网机械稳定性添砖加瓦。为实现这一目的，载网需预先进行双面亲水化。
镀碳膜：
当然，我们也可通过“增加支持膜厚度"的方法提升载网的机械稳定性。通常，亲水化前在载网支持膜一侧镀20-30 nm 厚的碳膜即可实现。
2
B盘：
抛光：
仔细观察金属载体B盘，你会发现其表面存在同心环状花纹，并不十分平滑。这对于传统HPF而言无伤大雅，但对于使用“WAFFLE METHOD"将薄样品和载网一起冷冻固定而言，存在较大的机械损伤隐患。对此，在实验准备阶段，我们需要机械打磨B盘，使其直接接触样品的一面平顺光滑。实操时，可先分别使用2000目、7000目、15000目砂纸逐一将铜盘梯度打磨至迎光观察光亮无痕。最后，再使用金属抛光膏精细打磨，体视镜下检验B盘平面一侧若已呈现镜面，则使用丙酮涮洗，确保抛光膏已全部去除。
预制备涂层：
为使载网在HPF后顺利从“华夫饼"套组中脱离，我们可在冷冻固定前为B盘做涂层处理。可选用1-十六碳烯孵育B盘至少15分钟，使用前侧吸掉B盘上多余液体。也可将卵磷脂粉末溶解在氯仿中（约50-100mg/mL）制成涂布剂，实验前将B盘浸入其中后取出晾干，即可在B盘表面形成一层极薄的分离涂层。在液氮下收样阶段，因为涂层的存在，只需用镊子轻戳B盘和载网边缘，即可轻松取出套组中的载网。
Leica让“WAFFLE METHOD"复现更轻松：
为进一步化简“WAFFLE METHOD"制样流程，获得更好的制样体验，Leica巧用“膜载体"上样套件，给出一种冷冻效果更好，又不用预先梯度打磨金属载体的简便“华夫饼"组装方式（如图3所示）。膜载体是直径6 mm、厚度略大于100 μm的高精平滑金片，相比于常用的铜盘或铝盘载体而言更薄更柔韧更平滑。在高压冷冻固定中使用，不但能大幅提升冷冻速率，而且能更快平衡样品两侧压力，降低机械损伤，综合提高样品玻璃态转化质量。Leica借助膜载体天生优势，将其与“WAFFLE METHOD"相融合，更高效的捕获高质的超微结构。
图3. 中间片中的膜载体套件组装示意图。
下面将展开详细的实验操作说明，帮助大家更好理解如何使用膜套件组装“华夫饼"。（该实验方案使用酿酒酵母为测试样品，不同样本可能需要进行调整。）
材料：
Leica膜载体套件（6mm）
酿酒酵母
大豆磷脂粉末
氯仿
丙酮 (≥99.5%)
图4. Leica膜载体上样套件。从左至右：6毫米半圆柱弹道、6毫米中间片、膜载体、占位压环。
实验准备：
实验步骤：
请注意：在某些情况下，收样时会出现膜载体自然打开，小心收纳即可。
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