显微课堂 | 细菌样品扫描电镜制样流程

制样流程示意图

步骤:

配制0.1%多聚赖氨酸溶液：用无菌去离子水溶解多聚赖氨酸，充分混匀后， 4℃避光保存（现配现用更佳）。

取洁净盖玻片（提前用无水乙醇超声清洗并烘干），每片滴加200μL多聚赖氨酸溶液，确保均匀覆盖盖玻片表面，室温自然风干（约30–60 min，避免灰尘污染）。

将包被后的盖玻片放入无菌六孔板中，每孔1片，盖玻片编号与样品对应。

细菌悬液预处理：取对数生长期细菌悬液，室温 2,000-6,000×g离心5-10 min，弃上清，用0.1M PB溶液重悬清洗3次， 吸去上清，再加入500 μL 0.1 M PB溶液重悬（OD600≈0.5-1.0，避免浓度过高导致细胞堆叠）。

每片盖玻片中央滴加200 μL菌悬液，室温静置30s（或根据细菌黏附能力调整至1-5 min，确保细菌均匀吸附于盖玻片）。

吸弃多余菌悬液，用0.1 M PB（pH 7.2-7.4）轻轻冲洗盖玻片表面2-3次（沿孔壁缓慢加入，避免冲散细菌），去除未吸附的游离细菌。

前固定：滴加2.5%戊二醛固定液（用0.1 M PB配制，pH 7.2-7.4），覆盖样品，盖上孔板盖子，用封口膜封住，4℃固定过夜（或室温固定2-4 h，确保细菌结构稳定）。

清洗：固定后，用0.1 M PB溶液 冲洗3次，每次5 min，去除残留戊二醛。

后固定：滴加0.5%锇酸溶液（用0.1 M PB配制，pH 7.2-7.4），覆盖样品，盖上孔板盖子，用封口膜封住，常温静止0.5 h。

清洗：固定后，用0.1 M PB溶液 冲洗3次，每次5 min，去除残留锇酸溶液。

全程保持无菌操作（尤其固定前步骤），避免杂菌污染。

盖玻片包被后需风干，否则残留多聚赖氨酸可能干扰细菌形态。

离心转速和时间需根据细菌种类调整（如革兰氏阴性菌可适当降低转速）。

梯度脱水需严格按浓度递增顺序操作，避免跳级导致细胞结构破坏。