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课堂 | 连续断层 3D 重构中的超薄切片制备,ARTOS 3D

发布日期: 2019-10-24
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当需要以纳米级分辨率观察样品超微结构时,科学家通常借助电子显微镜(观察表面结构的扫描电镜 SEM 和观察内部结构的透射电镜 TEM)——它们是当前科研界可使用的大显微成像工具。

 

电镜成像要求对样品进行通常 20-150 nm的超薄切片,使用超薄切片机切割的切片厚度薄、表面平整、光滑且无人为干扰因素,因此可以满足电镜成像对制备样品的严苛要求。如果大量超薄切片具有样品结构的前后连续性,SEM 成像采集的图像就可以进行样品内部结构的 3D 重建,形成可用于分析的完整超微、精细立体图像,即连续断层成像技术(Array Tomography, AT)。

 

今天,小编简要介绍一下 AT 成功的关键环节:连续超薄切片样品制备。

 

 

111超薄切片之重要性111

AT 常用于细胞、蛋白质等生物 / 生物大分子结构的纳米分辨率、3D 结构观察和分析,主要步骤为包埋样品连续(超薄)切片、TEM / SEM 或光学显微镜对其进行成像、对获得的一系列图像进行重建分析。AT 可以获得的有效信息包括超微结构的定量、体积分析和细胞 / 蛋白的形态学数据等,相较于共聚焦显微镜获得的图像,具有更高的水平和空间分辨率(可达 0.2 nm)。

 

超薄切片主要用于 TEM 成像前的样品制备,以纳米分辨率观察样品内部结构信息。无污染且获取快速的超薄切片的主要优势在于:

  • 整个切片均可用于电镜成像,适合大尺寸样品分析;

  • 单张切片电子透射均一性好,保证结果可靠性;

  • 制备速度快,短时间即可获得大量切片;

  • 适用样品范围广,生物样本和工业材料均适用。

 

 

11超薄切片的基本原理11

对于 TEM 或者 3D 结构重建,样品高质量连续切片是前提。因此,一台如 Leica EM UC7 或者 EM ARTOS 3D(20-50 nm)(见图 1)一样稳定可靠的超薄切片机是开展实验的必备工具。

▲图 1. Leica 连续超薄切片机新品 —— EM ARTOS 3D

样品被安装在可上下前后移动的电动机械臂上,机械臂垂直上下移动、遇到固定的玻璃刀或钻石刀时,这条样品带被切下(图 2),然后刀台自动向左移动,按照设定的切片厚度完成第二条切割。同理,随后刀台再向左移动,完成第三条切割(图 3)。从刀片上直接取下切片是十分困难的,因为它非常薄且脆弱,徕卡超薄切片机采用温和水流托举的方式使条带不断分离,能够保证条带质量不被破坏同时操作极其简单(冷冻切片情况可借助显微操作),然后进行上电镜前的其它必要处理。

▲ 图 2. EM ARTOS 3D 超薄切片机样品切割位置基本结构

 

▲ 图 3. EM ARTOS 3D 制备的连续超薄切片条带

 

 

连续断层成像的样品制备

多数未处理的生物样品比较柔软,AT 成像前的样品制备主要包括下面几个步骤:

  • 组织固定

  • 样品水分抽提和包埋

  • 连续切片和切片条带收集

  • 切片染色以用于成像(如果需要)

后使用 SEM 或光学显微镜(通常荧光成像情况)对结构上具有连续性的切片进行成像,合成图像以进行 3D 重建和分析。

 

对于市面上多数超薄切片机,使用者在 AT 成像的样品制备时,通常会发现这是一项耗时耗力、中间一些操作必须手工完成的工作。EM ARTOS 3D 是 Leica 2019 年新推出的 3D 连续超薄切片机,能够自动化连续切片、显著缩短样品制备时间、减少人工操作、切片无褶皱、厚度均一、温和水流取条带、提高样品制备成功率等众多优点,在向下兼容普通超薄切片需要的同时,特别合适高通量切片和 AT 等前沿研究对样品制备的严苛要求 

 

 

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▲ 图 4. AT 技术获得的鼠淋巴结 3D 结构重建

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