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徕卡共聚焦课堂第三讲:光路篇

发布时间:2021-12-23      点击次数:421

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共聚焦显微是指一类可以记录光学切片的特殊光学显微镜。
通过照亮和观察单个衍射极限点,在激光共焦系统中实现光学切片。这需要两个光束段焦点一致,因此是“共焦的"。与宽场图像相反,共聚焦图像没有散焦模糊情况。这本身就是一个优势,因为样品深层的图像显示清晰,细节丰富。然而,最重要的优势是其具有微观特征的三维可视化潜力。沿三维(z-stack)采集图像序列后,由计算机重建和显示三维物体。
共焦照明
,通过将光源聚焦在小孔径(针孔)上,然后聚焦到样品中,实现点光源照明。当孔径足够小时,照明点仅受衍射限制,不受光源和孔径几何参数的限制。普通光源是大的面光源,是不可能将其聚焦到衍射极限的光点上。因此,尽管透过率非常低,这种聚焦照明光仍然是十分必要的(对于传统光源)。

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图1:用于共焦成像的照明。来自光源(Ls)的光聚焦于照明针孔(Pi),然后进入样品S。
 
激光作为光源具有非常高的准直度(良好激光中的光“极度平行")。因此,在不应用针孔的情况下,激光可以通过单个透镜聚焦到衍射限制的光点上。因此,大多数共聚焦显微镜没有照明针孔。光点的质量取决于激光的光束质量。如果质量不佳,也可以插入照明针孔。激光通常通过光纤耦合到共聚焦显微镜上。这些光纤本身也起针孔的作用。
激光的可聚焦性和高能量密度使其成为共聚焦显微镜的理想光源。激光的相干性不是共焦性能所需的特征。相反,这对光学设计师来说是一个挑战,因为它会引起假的干扰图案,因而需要谨慎的设计策略。
此外,传统激光器仅发射单一颜色(激光-“线"),这一事实本身也有局限,在多荧光成像和测量时,就需要复杂的多激光排列。白激光很巧妙地解决了多色成像的问题。

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图2:共焦(右侧区域)和非共焦成像的比较。在Feulgen染色的小鼠滋养层中。非共焦图像的很多信息并非来自焦平面。共焦光学消除了所有模糊的因素,使结构变得清晰。
 
共聚焦检测
大多数探测器具有相当大的敏感区域(光电倍增管通常为几平方厘米)。共焦光学器件需要点状感测。因此,必须通过在光束中插入一个小孔径(针孔)来执行光点检测。将样品的光聚焦到该针孔上,收集并记录透射光。
由于衍射图取决于数值孔径和波长,所以必须进行针孔检测。因此当这些参数改变时,必须调整针孔尺寸。
当物镜改变时(通常随数值孔径改变而改变),现代的共焦扫描显微镜会自动适当地改变针孔直径。因此,针孔通常设计为双层或多层光圈。
实际上,针孔的合适尺寸不仅取决于波长和数值孔径,还取决于显微镜中光学元件的内部放大倍数。
因此,在设计不同的显微镜中直接比较针孔直径不仅不可取,也是错误的。如果针孔直径未设置为最佳值,系统将无法顺利进行光学切片(即传输散焦模糊),或者在没有获得进一步的光学切片质量的情况下不必要地切断强度(导致不必要的噪声图像)。

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图3:共聚焦成像中的检测。来自样品S的光聚焦于观察针孔(Po),随后聚焦到检测器De上。
 
共焦扫描的光路
共焦扫描系统中的共聚焦光束路径只是点光源照明和点探测的结合。这种组合可作为光学刀使用。只有来自焦平面的光子才能传递到传感器。而来自其他地方的所有光子都被滤除。通过“空间滤波器"的方式实现光学切片。
由于在给定时间内,只有一个光点出现“共聚焦"成像,因此需要一个扫描设备以栅格模式在物场上移动该光点。通常情况下,光学镜安装在扫描电机上,用于执行扫描程序。在扫描全帧(通常)1,024行所需的时间方面遇到了瓶颈。通过引入每秒扫描8,000或更多行的高速扫描仪(共振扫描仪),实现了改进。
只有在反射光显微技术下才能实现良好的光学切片。这是近20年荧光显微技术蓬勃发展的原因之一(其他原因还包括免疫染色、DNA-杂交、荧光生物传感器、量子点和荧光蛋白的发明)。

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图4:从左至右:1. 照明锥不仅在焦平面内激发荧光染料,在其上下都会激发。此处用绿色双锥体表示。2. 发射针孔有效地截断从焦平面上方发出的光。3. 此外,来自焦平面下方的光也不会通过针孔。4. 在共聚焦系统中,只有来自样品的光才会到达检测器。检测针孔会有效拒绝来自其他区域的任何光。最终得到真正的光学切面。

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