徕卡共聚焦课堂第四讲：荧光寿命-一个适当的选择

SP8 FALCON-即时产生荧光寿命成像（FLIM）
我们经常听到别人抱怨荧光寿命测量：“寿命分析太复杂了！"但这种情况即将改变！新技术和新概念的发展促进了数据评估，意味着荧光寿命成像(FLIM)的速度提高了10倍，可以媲美标准共聚焦成像，且操作简单。
图为小鼠胚胎的寿命图像。722个视野拼接，拟合出4个独立的特征寿命。采集时间约1小时-传统方法约1天。

荧光成像远超您的想象！
荧光过程提供了两个用于成像的测量参数：强度和荧光寿命。荧光寿命是指分子停留在激发态的时间。可以通过观察足够大量的激发-发射事件集合来测量荧光染料的典型寿命。我们可以测量图像中所有像素的典型寿命，并将这些数字记入数组元素。那就是荧光寿命成像[1](FLIM，也称为τ-映射）。典型的荧光寿命范围在0.2到20纳秒之间。
荧光寿命与荧光染料的浓度无关。无论样品结构仅有零星荧光染料还是载满荧光染料：寿命信号始终相同，并表明在同一环境中存在相同的荧光染料。因此，荧光寿命不受光漂白的影响。样品深处的图像将比表面图像暗得多——但寿命并没有改变。这是寿命测定的主要优势。
如果分子环境刺激激发态衰变而不发射光子，则荧光强度会降低（淬灭）。荧光淬灭是一条单独的发射路径，因此在动力学上与荧光过程形成竞争关系。激发态存储现在可以通过一个以上的过程衰变，从而缩短荧光寿命。这种寿命的改变可用于收集分子环境的信息。
一种特殊类型的淬灭是将激发能量以非辐射的方式传递到相邻的不同荧光染料中：“荧光共振能量转移"[2]，FRET。此时，不仅第一个荧光染料（供体）变暗，寿命变短，而且第二个荧光染料（受体）在“错误的"激发颜色下开始发光。由于这种效果的产生需要两种荧光染料（小于10 nm）的密切接触，因此将其用作研究分子相互作用的“分子标尺"。它也是许多现代FRET生物传感器的基础，专门用于测量活体样本中的各种细胞内参数：Ca2+或其他离子浓度追踪、酸碱度、极性和电位测量、蛋白质相互作用等。
FLIM-标准
FLIM的黄金标准是“时间相关单光子计数"[3]TCSPC，它与多光子共聚焦显微镜兼容。用光脉冲照射样本，测量发射光子到达的时间。为重建典型的寿命，这种测量要在同一样本位置重复几次。需要测量几百个事件才能达到大约10%的准确度。然后将数据按时间分组放入直方图中。然后对该直方图中随时间出现的衰变进行数学拟合，并直接提供所需的荧光寿命（图01a-c）。

 
图01a：测量激光脉冲激发（蓝色箭头）后发射光子（红色箭头）的到达时间tᵢ。此处绘制了5个测量值。

 
图01b：到达时间的直方图，包括上述示例中五个事件的集合。大多数计数#时间都很短。直方图用指数衰减（红色）来拟合。

 
图01c：拟合显示，例如，两个单衰变（蓝色和绿色曲线），衰变时间t₁和t₂，振幅为A₁和A₂。求和将再次获得红色衰变曲线。
这个过程是精确的，并可以重复，但需要一定时间。测量后，系统在大约100纳秒的死区时间内准备好进行下一次发射。要录入400个事件，测量一个像素的时间达40微秒。一张512x512的图像大约需要12秒，这无法适应快速变化和移动的生命系统。
目前的解决方案需要一定的技术灵活性、复杂的手动数据处理和精密的评价程序。
新标准
徕卡显微系统推出了一款新型FLIM显微镜：SP8 FALCON（FAst Lifetime CONtrast）荧光寿命成像系统可以解决以上所有问题。
本系统基于混合探测器（HyD）[4]，是理想的寿命成像传感器，具有极短的死区时间。激光脉冲序列和发射光子脉冲都以高采样率即刻实现数字化，将测得的距离直接输入数据池。这些到达时间用于输出“快速-FLIM"图像。
新方法允许使用大多数激光脉冲，并应用一个过滤器来限制只有一个光子发射的脉冲事件。在第一个光子到达后不久，随即到达的光子不可避免的会被忽略，可以通过智能数学方法进行校正。基于以上种种因素，图像记录速度提高了10倍。
所有FALCON FLIM成像均集成在共聚焦显微镜中。记录FLIM就像激活一个额外的通道。用于3D、时间和光谱系列的多维采集模式可立即用于FLIM成像。例如标题图像：具有经典组织学染色的小鼠胚胎。使用NAVIGATOR软件，创建了722个图块，每个图块为512x512像素的图稿。原始图像有1.9亿像素。用四个指数对寿命进行拟合，并以颜色进行编码。
应用实例
在功能成像领域，我们希望监测小分子、离子或电势的动态变化。这通常是用荧光探针完成的。其中多数显示出强度和寿命的变化。也可以用荧光蛋白装饰蛋白质，并在活细胞中表达这些构建体。该技术利用FRET跟踪活细胞中的分子相互作用。最为现代化的工具是蛋白质或肽，它们与所需的分析物（例如Ca2+）结合，并装饰有一对进行FRET的荧光蛋白。结合分析物后，肽将发生构象变化，FRET将出现或消失。这些探针被称为FRET-生物传感器。生物传感器的一种是利用cAMP结合蛋白Epac[5]

 
图02：用游离态的cAMP刺激培养细胞，并用Epac FRET-生物传感器进行监测。在红色圆圈区域分析信号（平均到达时间tₐ）。随时间变化的图示见底部。由K.Jalink，B.van den Broek，NKI Amsterdam(NL)提供。
SP8 FALCON的新技术速度够快，可以在活细胞中使用化学传感器和FRET生物传感器进行荧光寿命成像。
无染色应用是分析活体材料中的内源性荧光。例如：癌细胞抑制细胞呼吸，倾向于无氧糖酵解(瓦博格效应)，这会导致积累更高浓度的荧光NADH_[6]。即使没有活检，多光子显微镜也能在皮肤组织中进行深度成像。同样，寿命对比度要可靠得多，因为深层的显微镜会受到吸收和阴影效应的影响，从而使强度信号失真。
传统意义上，不同的荧光染料以其不同的颜色来区分。如果激发和发射相同，仍然可以通过寿命进行区分。发射强度和寿命可以作为颜色的函数独立记录。因此，可见荧光染料的数量是发射光谱和拟合寿命的乘积。

 
图03：lt-染料分离的原理证据（6个信号）。用480 nm激发云杉叶的新鲜切片，在两个通道（顶部和底部行）中进行记录，每个通道可分开显示三个寿命（从左到右）。由Leica Microsystems的I.Steinmetz提供支持。
总结
徕卡显微系统的SP8 FALCON（FAst Lifetime CONtrast）共聚焦和多光子显微镜汇集了所有这些新技术和新概念，生成FLIM技术，适用于多个应用领域。相较于传统的TSCPS方法（时间相关单光子计数），图像采集速度快了10倍，是迄今为止寿命成像的黄金标准。从而可以使用寿命对比来监测活体样本的运动学和动力学情况。
其直接实现和自动化使研究人员不再需要耗时于硬件调整和数据评估。3D堆叠、延时序列、镶嵌扫描和激发或发射波长扫描等复杂的数据采集模式与FLIM技术无缝结合。

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