显微课堂 | “Waffle方法“：使用高压冷冻制备复杂样品

使用电镜载网作为载体，减少样品厚度，以支持高效的低温电子显微镜工作流程。

本文介绍了一种特殊的高压冷冻方法，即 "Waffle 方法 "的优点。了解 "Waffle 方法 "如何使用电镜载网作为高压冷冻的载体，从而减少样本厚度并支持复杂生物样本的高效低温电子显微镜工作流程。此外，本文还强调了现代 HPF 系统-徕卡显微系统公司 EM ICE 的优势，并列举了 EM ICE 用于 "Waffle方法 "的参考文献。

"Waffle 方法 "

高压冷冻（HPF）已成为低温电子断层成像技术（cryo-ET）的基石，它能以很高的保真度保存原始生物结构，尤其是在厚样本或复杂样本中。为此，通常要在冷冻样品，并所形成的最大200微米玻璃化区域。遗憾的是，玻璃化后的大体积样品，必须在多个维度上进行铣削，以制备样品薄片，然后才能进行电子断层扫描。

近年来有一种样品制备方法越来越流行：“Waffle方法"，特别是对于较厚的样品。这种方法的基础由McDonald等人在2010年奠定，并由Mahamid等人在2015年进一步调整，他们首先使用载网作为HPF铜盘之间的样品载体（图 4）。随后，Kelley等人在2022年的一项研究中正式采用了 "华夫饼法 "这一术语，对该技术进行了标准化，并将其应用扩展到各种生物系统中。

与标准的 HPF 厚样品相比，该技术的优势在于为后续的FIB铣削提供了更小体积的样品。样品被放入载网中，碳膜面朝下。这样，在HPF制备后，栅格内会形成一个玻璃化的 "圆盘"，厚度约为20-30 µm，而不是100-200 µm。因此，样品所需玻璃化冰层深度大大减少。图 1 显示了成功进行HPF制备后，电镜载网上的小鼠海马脑切片荧光图像（Matsui等人，2024年）。

图 1：HPF 制备后载网上的小鼠海马脑切片结果；绿色荧光为PSD95-EGFP。Aya Matsui, Cathy Spangler, Johannes Elferich, Momoko Shiozaki, Nikki Jean, Xiaowei Zhao, Maozhen Qin, Haining Zhong, Zhiheng Yu, Eric Gouaux (2024) Cryo-electron tomographic investigation of native hippocampal glutamatergic synapses eLife 13:RP98458;

载网骨架可以稳定网格方格中的结构，以便进行FIB铣削，尤其是在获得约200纳米薄片时。在Kelley等人绘制的图2中，我们可以看到隐藏在图像下的载网骨架。在载网骨架上方，有5对明显的沟槽，以便随后对目标薄片进行精细铣削。

图 2：5 对预制沟槽的Waffle样品的扫描电镜图像。在图像的下部，可以看到电镜载网的栅条。比例尺：100 微米。Kelley, K., Raczkowski, A.M., Klykov, O. et al. Waffle Method: A general and flexible approach for improving throughput in FIB-milling. Nat Commun 13, 1857 (2022).

图 3 显示了一个薄片样品，在所有方向上都有微孢子虫，它是通过 "Waffle方法 "制备的，没有使用冷冻投入技术。

图 3：一个完整的Waffle薄片样品（右侧为缺口磨盘）的SEM图像，显示了微孢子虫孢子的几种排列方向。比例尺：10 微米。Kelley, K., Raczkowski, A.M., Klykov, O. et al. Waffle Method: A general and flexible approach for improving throughput in FIB-milling.Nat Commun 13, 1857 (2022).

除了上述优点外，载网还可以最终安装到低温-TEM 固定器中，而标准厚样品则无法做到这一点。这就避免使用复杂的样品转移方法，以及将薄片转移到特定支架上进行低温 TEM 层析成像的危险步骤。

先进的自动高压冷冻仪：EM ICE

EM ICE 高压冷冻机特别适用于 "Waffle方法"，因为它有几个主要特点，符合该方法对精确性、可重复性以及与大体积或结构化样品的兼容性的要求：

兼容载网作为样品载体

“Waffle方法 "是将样品放在由两个抛光铜盘夹着的载网中。EM ICE支持根据试样需要定制铜盘和隔板，从而实现一致的试样厚度的冷冻几何形状。根据试样的大小，可使用不同的载网类型（网格孔直径从90微米到500微米不等，通常为正方形，也有六边形）。

图 4：使用"Waffle 方法 "的 HPF 典型设置。

高通量和可重复性

EM ICE设计用于可重复的冷冻循环，这在制备多个 "Waffle "样品用于高通量低温 FIB 铣削时至关重要。

样品干扰小

该系统可对样品进行温和处理，并快速转移到液氮中，从而降低了机械损伤或蜕变的风险--这在处理精细的载网组件时尤为重要。

与下游低温工作流程集成

EM ICE广泛应用于包括Cryo-FIB/SEM和Cryo-ET在内的工作流程，使其成为 "Waffle方法 "的天然之选，而 "Waffle方法 "依赖于从冷冻到铣削，再到成像的有效工作流程。

使用EM ICE进行"Waffle方法 "样品制备

最近，Pge等人（elifeSciences）将使用 "Waffle方法 "的样品制备技术扩展到植物组织 。研究人员使用了苔藓、拟南芥和双色柠檬（海熏衣草）的组织。

Schiøtz等人在《自然-方法》（Nature Methods）杂志上介绍了 "序列提取"（Serial Lift-Out）技术，该技术结合了HPF和高通量Cryo-FIB铣削技术，可从单个样本中提取多个薄片。这样就能对多细胞生物体进行体积取样，例如C. elegans同时保持大面积组织的完整的超微结构。

在eLife中， Matsui等人将HPF应用于小鼠脑组织，并将其与低温光电联用技术相结合，研究原生海马突触 。他们的方法确保了神经回路的快速玻璃化，从而可以在原位对AMPA受体进行精确定位和结构分析。

Berger等人（bioRxiv）证明了HPF与氙等离子FIB铣削技术的兼容性，实现了从厚样品中高通量制备薄片。他们的工作实现了近原子分辨率的重建，如大肠杆菌4.0 Å 的核糖体 ，强调了 HPF 在保护大分子结构方面的关键作用。

致谢

本应用说明展示了以下文章的图片，采用知识共享许可协议（署名 4.0 国际版），如 CreativeCommons

Waffle Method: A general and flexible approach for improving throughput in FIB-milling.

Kelley, K., Raczkowski, A.M., Klykov, O. et al.

Nat Commun 13, 1857 (2022)。

Cryo-electron tomographic investigation of native hippocampal glutamatergic synapses

Aya Matsui, Cathy Spangler, Johannes Elferich, Momoko Shiozaki, Nikki Jean, Xiaowei Zhao, Maozhen Qin, Haining Zhong, Zhiheng Yu, Eric Gouaux

eLife 13:RP98458 (2024).

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