显微课堂 | Drosophila（果蝇）研究显微镜使用指南

提高果蝇工作步骤的效率，促进与发育生物学、遗传学和神经科学有关的研究。

一个多世纪以来，果蝇（典型的黑腹果蝇）一直被用作模式生物。原因之一是果蝇与人类共享许多与疾病相关的基因。果蝇经常被用于发育生物学、遗传学和神经科学的研究。果蝇的优点包括易于饲养且成本低廉、繁殖速度快、基因组测序以及可获得各种基因品系。使用徕卡显微镜可以进行高效的果蝇研究。

使用黑腹蝇蛆的常规实验室方法包括：

1. 向胚胎显微注射DNA进行基因改造（转基因）。

2. 通过观察解剖特征对果蝇进行基本分类的 "拣蝇法"。

3. 荧光筛选，例如观察胚胎或幼虫，找出成功转染荧光蛋白的胚胎或幼虫。

4. 用于研究大脑或其他解剖结构的解剖案例。

5. 在实验过程中对筛选出的果蝇（活体和固定的）或解剖结构进行成像和记录。

这些步骤通常使用体视显微镜、复合显微镜或共聚焦显微镜进行。

果蝇的转基因通常是通过向果蝇胚胎显微注射DNA来完成的。进行显微注射需要显微镜。

胚胎显微注射面临着一些挑战：

1. 显微镜物镜下有足够的空间放置微型注射器。

2. 视野小限制了同时观察胚胎的数量。

3. 伤害胚胎的风险。

4. 在进行注射时保持舒适，因为注射需要重复动作，可能需要几个小时。

使用徕卡体视显微镜可以克服这些挑战，该显微镜为用户提供以下功能：

1. 视野大，可同时看到多个胚胎。

2. 配件使显微镜更符合人体工程学，最大限度地减少用户的疲劳和劳损。

3. 与市面上的显微操作设备兼容。
   
   

   图 2：示意图展示了将DNA微量注射到果蝇胚胎中的过程。

根据特定的表型或解剖特征对果蝇进行分类，即所谓的 "拣蝇"，必须在显微镜下进行。

与拣蝇相关的挑战有：

1. 一些细节可能难以观察到。

2. 小视场限制了同时观察到的果蝇数量。

3. 既要有足够高的放大倍率来观察解剖细节，又要有足够大的景深来将果蝇按（分类）到不同的组中。

4. 用于麻醉果蝇的CO2（二氧化碳）垫对底座来说太大，存在风险。

然而，使用徕卡体视显微镜可以克服这些挑战。用户可以获得以下好处：

1. FusionOptics技术可同时实现更高的分辨率和更大的景深。

2. 更舒适的设置，减少疲劳和劳损，采用人体工程学模块。

3. 使用中等大小的底座或摇臂支架，为二氧化碳垫留出足够的空间。

图 3：使用徕卡体视显微镜进行果蝇分拣操作。通过二氧化碳（CO₂）管对果蝇进行麻醉（1），并在分拣过程中使用带有 CO₂ 的果蝇操作垫维持麻醉状态（2）。样品由奥地利维也纳大学神经生物学系的T. Hummel 提供。

要找到成功转染荧光蛋白的果蝇胚胎或幼虫，就必须对其进行荧光筛选。这项工作使用荧光体视显微镜进行。

对胚胎或幼虫进行荧光筛选有一定的难度：

1. 信噪比（SNR）过低导致分辨率不足，从而难以分辨不同表型的细微差别。

2. 通常情况下，分辨率和景深之间存在折衷关系。

3. 果蝇及其食物发出的自发荧光。

4. 长时间使用显微镜时保持舒适。

使用徕卡体视显微镜可以克服这些筛选难题。它可以帮助用户完成以下工作：

1. 利用TripleBeam技术降低荧光背景噪声，提高信噪比。

2. 得益于FusionOptics技术，可同时获得高分辨率和大景深效果。

3. 利用计算清除功能，即使是胚胎或幼虫深处的细节也能清晰地显示出来。

4. 多种对比方法和专门设计的反射镜，配备Leica透射光底座，可减少自发荧光。

5. 使用人体工程学模块，用户可以舒适地工作，减少疲劳和劳累。

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图 4：使用THUNDER显微镜拍摄并经过LVCC（大体积计算清除）处理的黑腹果蝇卵泡。绿色区域为aPKC染色，洋红色区域为Dlg染色。样品由美国加利福尼亚大学伯克利分校的M. Khoury和D. Bilder提供。

解剖果蝇是在必须研究大脑或其他解剖结构时进行的。这也需要显微镜。

果蝇解剖面临的挑战有：

1. 标本小而易碎，因此很难看到内部结构。

2. 在大脑解剖过程中，应避免与空气接触。

3. 实现速度和精度都很困难。

4. 在溶液中解剖果蝇时的反光。

使用徕卡体视显微镜可以克服解剖难题。用户可以利用以下优势：

1. 利用体视显微镜轻松确定蝇类标本的三维方向。

2. 采用人体工程学模块，工作舒适，减少疲劳和劳累。

3. 使用偏振镜和各种照明选项可以大大减少溶液表面的反射。

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图 5：使用M125体视显微镜解剖的三只果蝇大脑图像。果蝇大脑表达红色荧光蛋白（RFP）。图像由徕卡荧光体视显微镜拍摄。大脑的取向如图所示，以便后续共聚焦成像。样品由奥地利维也纳大学神经生物学系的L. Geid和T. Hummel提供。

在对果蝇进行筛选和可能的解剖之后，往往需要对实验进行成像和记录。这一步需要一台带有摄像头和软件的显微镜。

果蝇实验成像和记录方面的主要挑战是：

1. 避免蝇类标本因光和热的照射而受损，尤其是在实时成像过程中。

2. 标本移出视野。

3. 由于光散射的原因，在对厚结构或标本深处的结构成像时，会出现焦外模糊的情况。

4. 获取3D标本的对焦2D图像。

徕卡显微镜可以克服这些挑战。以下是其优势：

1. 使用高帧频、高灵敏度的显微镜相机记录快速事件。

2. 借助计算清除功能，快速查看果蝇标本深处的细节。

3. 使用宽场显微镜对果蝇标本进行更柔和的光照射。

4. 利用扩展景深 (EDOF) 成像技术获取整个Z叠的同焦图像。

5. 利用光片和共聚焦显微镜获得更高分辨率的果蝇标本图像。

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图 6：果蝇胚胎神经元中钙瞬变的时间序列成像，每幅图像（A–F）代表约10.5秒的平均时间间隔。图像使用THUNDER成像仪和计算清除技术获取。样品由美国加利福尼亚州Clandinin实验室的A. Carreira-Rosario提供

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