当光遗传学遇上电镜：如何把神经元被“点亮”的一瞬间冻结下来？

但对于神经科学来说，“让神经元在想要的时刻被激活"只是故事的一半。

另一个问题随之而来：光脉冲触发神经活动之后，在随后短暂的时间窗口里，突触囊泡、细胞膜以及其他超微结构究竟发生了什么？

传统电子显微镜能够提供空间分辨率，却通常看到的是已经固定下来的“静态结果"。而许多神经活动发生得非常快。于是，一个很自然的技术需求出现了：能不能先精准触发一个生物学事件，然后在预定的时间点把它立即“冻结"，最后再进入电镜观察？

这正是“Flash and Freeze"思路的价值所在。

高压冷冻（High-Pressure Freezing, HPF）的作用，是快速冷冻固定含水样本并尽可能保存其超微结构。Leica EM ICE进一步将高压冷冻与光刺激、电刺激结合，可在关键事件发生后进行冷冻固定。

同步光刺激和高压冷冻，可以在毫秒级时间精度和纳米级空间尺度上研究高动态过程，包括突触神经传递过程中发生的结构变化。

这里真正重要的不是简单地“照一下光，再把样品冻起来"，而是建立刺激与冻结之间可控的时间关系。

EM ICE将光刺激集成到系统中，可使用蓝光、紫外光、绿光、红光和琥珀光等5种LED模块；相关光脉冲参数及刺激到冻结的时间关系可以纳入实验设置，并记录到日志文件。目前可提供的波长分别为450、380、523、660和597 nm。

这意味着研究者可以围绕目标生物学事件来设计时间节点，而不是只获得刺激前与刺激后的两个终点。

这一方法在突触研究中的意义尤其直观。

徕卡已有应用资料介绍了将光刺激与EM ICE高压冷冻用于小鼠急性脑片及器官型脑片培养的“Flash and Freeze"工作流。研究首先通过实验确定刺激条件，再进行光刺激与高压冷冻，之后经过冷冻置换、包埋、超薄切片和TEM观察，对突触囊泡及相关结构进行分析。

也就是说，研究人员尝试回答的不再只是：“这个突触长什么样？"

而进一步变成：“在受到刺激后的这一时刻，突触正在发生什么？"

这也正是光遗传学与电镜制样技术相遇之后非常值得关注的方向，从对动态过程进行精确操控，到将其中的重要时间节点转化为可以进一步研究的超微结构信息。

EM ICE采用无醇冷冻原理，全自动上样至冷冻过程仅需1秒，同时支持光刺激或电刺激与高压冷冻结合。对于需要研究动作电位、膜运输、突触传递以及其他快速动态过程的实验而言，它提供的核心能力不是单纯提高“冻结速度"，而是帮助研究者把刺激、时间与超微结构观察连接起来。

从今年光遗传学再次受到全球关注，到“Flash & Freeze"不断进入突触和细胞动态研究，一个趋势正在变得更加清晰：我们不仅希望看见生命结构是什么样，还希望知道，当生命活动发生的那一瞬间，它究竟是什么样。

而把那个稍纵即逝的瞬间真正保存下来，或许正是下一张关键电镜图像开始的地方。

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