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情景导入
在树脂块中定位特定细胞或结构，是超薄切片技术中最持久的挑战之一。传统的光学辅助工具（体视显微镜、干涉色和明场成像）有助于确定块面方向和评估切片厚度。不过，它们仍然无法确定荧光标记感兴趣区域的确切位置。
通过在嵌入树脂后，保留样品内的荧光信号，从而可直接观察到区块内的目标结构。
这一功能将修块从一个不确定的过程，转变为一个有指导的工作流程，确保有效地暴露感兴趣的区域，并将损失降低。
Leica UC Enuity将荧光成像，与体视显微镜和明视野显微镜，以及自动修块程序集成在一起。这种组合使用户能够实时观察标记的细胞，同时控制切片参数。通过使光学图像与荧光信号相一致，UC Enuity能够精确导航到嵌入目标并减少样品浪费。
本章以9月24号推文内容为基础。在这里，重点从制备均匀的切片，转移到使用荧光作为导航工具。这些技术对于CLEM等关联工作流程尤为重要。因为在这些流程中，荧光和EM数据之间的精确对应至关重要。在下一篇中，我们将看到显微CT如何从另一个维度，将定位能力从光学信号，扩展到体积成像数据。
嵌入Lowicryl® HM20的秀丽隐杆线虫；咽部显示红色荧光（mCherry）。图中显示的是，EM AFS2流动腔底部形成的树脂胶囊的正视图。
胶囊是经过人工预修剪的。随后，利用UC Enuity的自动修块功能AutoTrim，在蠕虫荧光的引导下自动修整块面。两个正方形相对于图像的边长均为250 µm。
标准配置
使用标准方法制备vEM样品时，重金属和环氧树脂的浓度 会影响荧光信号，使这种方法有时候不太适合，或不适合光学显微镜的方案。
为克服这一问题，我们设计了一种方法，以在样品制备过程中，保存荧光信号，以定位标记结构。
样品固定
制备电子显微镜（EM）标本的首要任务是固定样本。
在本文重点介绍的方案中，使用物理低温固定技术，来替代传统的化学固定技术。在这种方法中，样品几乎在瞬间被高 压冷冻（HPF），防止冰晶形成，并使水保持玻璃状（玻璃化）。这被认为是一种尽可能接近自然的状态。对于细胞层，可使用投入式冷冻装置（如Leica EM GP2）进行低温固定，但对于颗粒和深度达200微米的较厚样品，则要进行HPF（如使用EM ICE)。
冷冻替代和染色
然后，在低于或接近-90°C的溶剂中对样本进行脱水（冷冻替代，FS），以保存超微结构。化学固定相比，冷冻替代被认为能提供更好的保存效果。一般来说，对于树脂内荧光，丙酮优于乙醇用于脱水，但为了避免荧光损失，暴露时间要短。
由于有机材料和包埋树脂的电子密度较低，因此在FS过程中会加入重金属化合物，如醋酸铀酰（UA）和，它们对蛋白质和脂质具有特殊的亲和力。
由于会影响荧光，因此在下面的冻存替代过程中使用了低浓度的UA。
渗透和包埋
替代水之后，使用溶剂稀释树脂，以促进样品在固化前的渗透。为了保持荧光信号，并避免固化温度过高，Lowicryl® HM20或LR White等丙烯酸树脂是选择。此外，丙烯酸树脂可在低温（约-20°C）下使用，有助于保持样品结构的完整性。
示例方案1-细胞样本
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低温固定
对于HPF，细胞通常生长在蓝宝石圆盘上（因为玻璃会被HPF破坏），或以悬浮液的形式直接置于样品架上。标准装配方法和HPF方案可从不同制造商处获得（如EM ICE）为防止细胞外冰晶的形成，并提高冷冻质量，可使用冷冻保护剂。在组装用于高压冷冻的样品载具时，通常会使用非渗透性液体，如右旋糖酐（15-20%）、Ficoll®（5-20%）或未稀释的1-十六碳烯。
2
冷冻替代和染色
如上所述，冷冻置换使用的是溶于丙酮中0.1%的低浓度醋酸铀，根据细胞类型和UA储存来源的不同，有些方案甚至将UA浓度降至0.04%。虽然有些方案建议在-90°C下，初始孵育72小时，但细胞样本也可使用较短的孵育时间，以加快这一漫长的过程（图1）。为了最大限度地减少长时间操作过程中的人工操作，最好使用带液体处理功能的自动冷冻替代系统。徕卡开发了这样一种设备，即自动冷冻置换系统EMA FS2，它配备了一个液体处理装置，即冷冻置换处理器EM FSP。
如图1所示，细胞样本在0.1%的醋酸铀和无水丙酮中保存9小时，温度为-90°C。之后温度逐渐升至-45°C，并在此温度下保持5小时，以便UA对样品进行染色（具体时间取决于样品）。然后，通过三组丙酮清洗步骤，去除乙酸铀酰，完成冷冻置换和染色步骤。
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渗透和聚合
然后，开始用浓度不断增加的Lowicryl® HM20树脂浸润，浸润过程持续2小时，同时将温度升至-25°C。温度保持在-20°C以下，这是为了保持样本的完整性，并利用树脂的低粘度进行有效浸润，避免蛋白质破坏。在三个树脂交换周期，以及随后48小时的主要紫外线聚合过程中，温度都保持在-25°C。在此过程中，EM AFS2上的液体处理装置，被自动紫外线灯取代。
在最后的9小时固化过程中，紫外线聚合作用继续进行，同时温度升至20°C，在此温度下可对样品进行后续修剪和切片处理（例如，请参阅本节荧光微调应用说明）。
图1：用于EM AFS2的冷冻替代方案1，适用于较小的细胞样本。
实例方案2-类器官与胚胎样本制备
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低温固定
要冷冻固定器官组织、组织块或果蝇等等比细胞大的模型生物样本，HPF是方法，但样品厚度极限约为200微米。
由于HPF期间应避免不必要的/非样品空间，因此可选用不同容积的样品架适配样品。由于细胞外空间比细胞大得多，因此形成破坏性冰晶的风险要高得多。因此，冷冻保护剂的使用更为频繁。
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冷冻替代和染色
为了保持荧光，还在无水丙酮中加入低浓度的0.1%醋酸铀酰进行冷冻置换。有时会在胚胎或卵室上穿孔，以改善浸润。
从图2可以看出，替代阶段比细胞长得多，即72小时，之后以3°C/小时的速率升温。随后，样品在-45°C下再放置5小时，以确保适当染色效果。这是进行染色的关键步骤，因样本而异。Ronchi等人认为，这对他们使用的样本（如果蝇卵巢和幼虫、乳腺器官）来说是选择。
图2：用于类器官、组织、果蝇组织或小胚胎的EM AFS2冷冻替代方案2。
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渗透和聚合
在用无水丙酮进行三轮清洗后，使用Lowicryl® HM20浸润样本，在四个6小时的时间浸润阶段内，树脂浓度不断增加。在第三和第四个树脂浸润阶段中，温度升至-25°C，以进一步提高渗透率。温度保持-20°C以下，以保持样本的完整性，并利用树脂的低粘度进行有效渗透，避免蛋白质破坏。在交换和再填充的三个循环过程中，温度保持在-25°C，随后进行48小时的紫外线聚合。在此过程中，EM AFS2上的液体处理装置被紫外线灯取代。在最后升温至20°C的过程中，确保树脂硬化并稳定标本，以便进行后续的超薄切片步骤（例如，请参阅本应用说明荧光切片应用说明）。
为了利用荧光，对块面进行靶标修块，并进行包埋后 CLEM实验（图中未显示），我们对上述方案进行了调整，使其适用于在基因上表达咽部和肠道标记的线虫（图3）。手动预先修整流通池。
举例：
图3：荧光标记的秀丽隐杆线虫包埋于Lowicryl® HM20树脂。左图：从EM AFS2流动室取出的聚合块俯视图。正方形表示蠕虫前咽的红色荧光信号。比例尺：200 µm。中心：方形区域特写双通道图像，绿色显示肠细胞的内质网，红色显示前咽。比例尺：100 µm。右图：自动修块后，包含目标蠕虫的区块面的俯视图。树脂块右侧是圆形的，这主要是由于通流室的边缘。比例尺：100 µm。
随后，在UC Enuity上设置修块区域，以创建包含目标蠕虫的块面，并自动执行修块，之后无需用户再进行调整。
详细的荧光自动修块方案如下：
初始替代时间为48小时，随后是13小时的升温至-45°C。随着HM20浓度的增加，递增时间为4小时。这些步骤调整到介于上述方案持续时间之间。这与样品的经验、尺寸、表皮厚度和渗透性的经验是一致的。
图4：用于秀丽隐杆线虫的冷冻替代方案。
总结
在本文中，我们了解到在电子显微镜样品制备过程中可以保存荧光。我们展示了相关方案并解释了主要步骤。关键步骤是高压冷冻和使用低浓度UA进行冷冻置换，以形成电子对比，然后嵌入丙烯酸树脂中。
该工作流程使研究人员能够在以下过程中使用荧光定位修块，并可能在切片过程中进行靶向控制。
尽管如此，仅靠荧光引导对刚兴趣区域，进行高效修块，就已使研究人员能够将电子显微镜数据，仅集中在目标区域，从而减少电镜拍摄时间和总体成本。
树脂内荧光还允许应用于CLEM。这一点尤为有用，因为在为EM制备样品的过程中，样品的收缩可能不均匀，导致包埋前的荧光和包埋后的EM数据无法精确关联。
荧光引导靶向。传统的视觉线索有助于确定块面的方向，但无法揭示树脂中的标记结构。树脂内荧光解决了这一问题，它通过特定的包埋方案保留荧光信号，从而可以直接修块到细胞靶标或标记的细胞簇。这种靶向方法减少了不必要的切割，提高了效率，尤其在体电子显微术和相关研究中。
体视和干涉视图仍然不可少。体视显微镜可提供块面的必要概览，而干涉色仍然是快速可靠的厚度测量工具。当与荧光相结合时，这些方法可提供互补信息：体视和干涉可确定方向和厚度，而荧光可精确定位目标本身。
明场辅助对齐。在明视野中，观察刀具和块面之间的光隙，可让操作员在尝试切割前优化定位。这增加了信心，有助于避免在切割定位目标时，出现代价高昂的错误。同时，集成工作流程节省时间。
在显微镜和成像系统之间切换会减慢制备速度并增加变异性。UC Enuity将荧光体视显微镜和引导式修剪整合到一个程序中，简化了导航和切割。这样可以减少设置时间，最大限度地减少用户误操作，并确保多个操作员的结果具有可重复性。
CLEM工作流程同样也能从中受益。荧光和电镜信号之间的精确关联对CLEM研究至关重要。通过可视化树脂中的标记细胞，UC Enuity使研究人员能够无缝连接数据集，使光电关联项目更快、更可靠。
渐进式技能培养。新用户可以从明场和干涉检查开始，学习切片厚度和对齐的基础知识。随着信心的增强，可以引入荧光导航，分阶段培养技能。这种分阶段发展的方法，可确保实验室能够采用荧光工作流程，而不会让受训人员感到力不从心。
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